洗衣粉—加酶洗涤剂中碱性蛋白酶活力的测定

本方法参照标准ZBY 40018-1989。适用于各种加酶洗衣粉的碱性蛋白酶活力的测定。

(一)方法概述

在一定的温度、一定的pH值下，酪蛋白能被酶水解生成含有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸等)，这些水解产物在碱性条件下能将福林试剂还原生成蓝色化合物。测定样品与空白的光密度值的变化。校正由于阴离子表面活性剂存在，对酶水解产物定量的干扰，即可算得样品中的碱性蛋白酶的酶活力。

(二)试剂和仪器

(1)福林试剂于2000ml带有回流装置的圆底烧瓶内加入钨酸钠(Na₂W0₄·2H₂0)100g和钼酸钠(HG 3—1087)(Na₂M00₄·2H₂O)25g，蒸馏水700ml，85％磷酸(GB l282)50ml，浓盐酸(GB 622)100ml，缓慢沸腾回流10h。拆去冷凝器后加入硫酸锂(Li₂S0₄)50g，蒸馏水50ml，在通风橱中加入数滴溴水(GB l281)(99％)，再煮沸l5min，以除去多余的溴(冷却后若溶液仍呈绿色，则需再加溴，再煮沸除去过量的溴)。冷却后加蒸馏水定容至l000ml，混匀过滤。试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用时以1份原福林试剂与2份蒸馏水混合成稀福林试剂。

(2)碳酸钠(Na₂CO₃)(GB 639)，0．4mol／L溶液称取无水碳酸钠(Na₂CO₃)42．4g，以蒸馏水溶解定容至1000ml。

(3)三氯乙酸(C1₃CCOOH)  (HG 3-1105)，0．4mol几溶液  称取三氯乙酸65．4g，以蒸馏水溶解定容至l000ml。

(4)硼砂一氢氧化钠缓冲液，pH值11．0。

A液  称取硼砂(GB 632)19．08g，用蒸馏水溶解定容至1000ml。

B液  称取氢氧化钠(GB 629)4g，用蒸馏水溶解定容至1000ml。

取A液与B液等量混合，测定pH值，若有偏差则用A液或8液调节至pH值11．0。

(5)2％酪蛋白溶液  精确称取干酪素2．0000g，用少量0．5mol/L氢氧化钠溶液润湿后加适量pH值11．0硼砂缓冲液，在沸水浴上加热至溶解，移入l00ml容量瓶内，用缓冲液定容至刻度，摇匀，放入4℃冰箱中保存备用，保存期不超过l周。

(6)酪氨酸(HG 990)，100μg／ml溶液精确称取经105g干燥恒重的L一酪氨酸0．1000g，加入少量1mol／L盐酸溶液，在热水浴上使溶解，然后用0．1mol／L盐酸溶液定容至l00ml。取此溶液10ml，用0．1mol／L盐酸溶液定容至100ml，即得100μg／ml的酪氨酸溶液。

(7)超级恒温水浴。

(8)酸度计分度值0．1pH(如PHS-2型)。

(9)分光光度计  波长范围360～800nm，具有0．5cm比色皿，680nm滤光片，如国产721型分光光度计。

(10)容量瓶100ml和250ml。

(11)试管  φ16mm×160mm、φ19mm×190mm(薄壁)。

(12)移液管lml、2ml、5ml、10ml。

(三)操作步骤

1．绘制标准曲线

为了确定酪氨酸浓度与光密度值的对应关系，需配制一系列浓度的标准酪氨酸溶液，与福林试剂反应显色，测定光密度值，绘制标准曲线，求得曲线的斜率k值。

(1)按表1配制一系列浓度的标准酪氨酸溶液。

表1  标准酷氨酸溶液

(2)将按表1配制的各种浓度的酪氨酸溶液各取lml(需做平行试验)，分别加入0．4mol／L碳酸钠溶液5ml，稀福林试剂lml，置40℃水浴中显色l5min，用分光光度计在680nm波长下，以蒸馏水作对照，测定光密度值。以光密度值为横坐标，溶液中酪氨酸含量(μg)为纵坐标，绘制标准曲线，此线应是通过零点的直线，由此求得斜率k值。

2．样品溶液的配制

(1)取样方法将500g加酶洗涤剂样品放入250ml广口瓶内，上下左右来回摇动后，用勺从中间取样，重复操作数次，共取样品5g。

(2)样品溶液的配制  按取样方法准确称取样品两份(每份为5g，准至0．2mg)，对粉粒状样品加入少量pH ll．0。缓冲液湿润，用玻璃棒将样品颗粒研碎后，。加少量缓冲液搅匀，将上层液小心倾人容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复捣碎3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至250ml，摇匀待测。对液体样品用pHll．0缓冲液定容至250ml，摇匀待测。

3．操作程序

将2％酪蛋白溶液置于40℃恒温水浴中预热3～5min，同时将含有l．0ml样品溶液的试管(需做平行试验)预热3～5min。

移取2％酪蛋白溶液lml加入样品溶液中，摇匀，同时准确记录反应时间。

反应l0min后即加入0．4mol／L三氯乙酸溶液2ml，摇匀，用滤纸滤去沉淀物。移取滤液l．0ml，依次加入0．4mol／L碳酸钠溶液5ml、稀福林试剂lml，置于40℃恒温水浴中显色l5min。

用分光光度计，在680nm波长下，以蒸馏水作对照，测定光密度值。

空白移取样品溶液l．0ml(需做平行试验)，置于95℃沸水浴中钝化5min，取出后依次加入2％酪蛋白lml、0．4mol／L三氯乙酸2ml，摇匀后过滤，其余同样品。

(四)计算

1．酶活力单位(用U表示)

在测定条件下，lmin内使酪蛋白分解出相当于lμg酪氨酸的酶量，定为一个活力单位，简称lu。

    2．酶活力(EA)以酶活力单位数腕(u／g)表示，按式(1)计算

(1)

式中    A——样品与空白的吸光度之差；

4——酶水解液总体积，ml；

10测定反应时间，min；

k——标准曲线的斜率；

       m——样品的质量，g；

        f——根据洗涤剂中LAS含量由附录表2查得的校正系数；

V——样品溶液的体积，ml。

表2相应于LAS含量的校正系数

本方法的精密度在±5％以内。

注:

本节参照标准GB／T l3171—1991。

该标准所规定的洗衣粉属于弱碱性产品，适合于洗涤棉、麻和化纤织物，按品种、性能和规格分为含磷(HL类)和无磷(WL类)两类，每类又分为普通型(A型)和浓缩型(B型)，命名代号如下：

 (1)HL类  含磷酸盐洗衣粉，分为HL-A型和HL-B型。

 (2)WL类 无磷酸盐洗衣粉，总磷酸盐(以P₂0₅计)不大于1．1％，分为WL-A型和WL-B型。

各类型洗衣粉应使用生物降解度不低于90％的表面活性剂，不得使用四聚丙烯烷基苯磺酸盐、烷基酚聚氧乙烯醚。

各类型洗衣粉的理化性能应符合表1的规定。

表1各类型洗衣粉的物理化学指标

各类型洗衣粉的使用性能应符合表2的规定。

表2各类型洗衣粉使用性能指标