脂质体以其低毒性､相对易制备､可避免药物的降解和可实现靶向性给药等优点,而被广泛作为药物载体使用,研究脂质体主要为其粒径､电荷及表面修饰等。磷脂是常用的脂质载体材料,以合成磷脂材料制成的脂质体与表面活性剂的相互作用,在国内相关研究极少,而国外已广泛研究,Claffey等首次采用UV及DSC法分析胆盐和卵磷脂在形成混合胶团过程中的双晶型现象,认为其变化与胆盐/卵磷脂的摩尔比的变化有关。大豆磷脂是天然的脂质体制备材料,有关大豆磷脂与表面活性剂的作用研究笔者未见报道,笔者分别以胆酸钠和脱氧胆酸钠考察其与大豆磷脂载体间的作用,研究大豆磷脂载体的粒径及其混悬液的浊度变化特征,分析脂质体和胆盐形成脂质胶团的动态过程及相关机制,为探讨其体外载药及体内､外释药性能提供依据。
1 仪器与材料
Senco-R系列旋转蒸发仪及Senco W201B恒温水浴锅(上海申生科技有限公司);UV-2100紫外可见分光光度计(日本岛津);H-8000透射电镜(日本日立);TSM超细微粒粒度分析仪(上海理工大学动力工程学院研制);注射用大豆磷脂(≥96%,上海福达制药有限公司);胆酸钠及脱氧胆酸钠(Serva进口上海化学试剂站分装)。
2 实验方法
2.1 脂质体的制备
称取大豆磷脂约200mg,置于250mL梨形圆底烧瓶中,加入数粒直径约4mm的玻璃珠,加无水乙醚10mL,通入氮气,稍加振摇使磷脂溶解,采用旋转薄膜蒸发法制成均匀的脂质干膜,以氮气流吹尽残余乙醚,然后加入分散介质,振摇数分钟,使成乳白色脂质混悬液,再经微孔聚醚砜滤膜片挤压过滤5次,即得均匀分散的脂质体。
2.2 脂质体的外观形态
取一滴待测脂质体混悬液于样品点滴反应瓷板的凹槽内,并将喷碳铜网置于试液上(膜面向下),维持1～2min后,取出铜网,用滤纸小片从铜网吸走边缘多余液体,同法将该铜网放在染液(2%的磷钨酸溶液,pH7.0)上进行负染色,沉积时间约30s,吸干多余染液,干燥后,以透射电镜观察磷钨酸染色铜网上脂质体的外观形态。
2.3 脂质体与胆盐混合液的浊度分析
浊度测定为表面活性剂对脂质体溶解作用的定量化研究提供非常方便的方法。取脂质体混悬液0.3mL,置入100mL的平底锥形瓶中,加入生理盐水25mL,混匀。然后以滴定管分别滴加不同体积的0.1%胆酸钠或脱氧胆酸钠溶液,在每次胆盐溶液加入后,以恒流蠕动泵和磁力搅拌方式将脂质体混悬液充分混匀,经蠕动泵循环取样,于500nm波长处测定吸光度值A500nm,由此评价脂质体混悬液的浊度(turbidity)变化。
2.4 胆盐对脂质体粒径分布影响
根据平行单色光照射微粒后的吸收及散射原理,本实验采用超细微粒粒度分析仪对脂质体混悬液进行粒度测定,并对加入胆盐后脂质体的粒径变化情况进行考察。相对折射率参数设置为1.1609,将样品经生理盐水适当稀释后,加入测定池中,遮光测定暗电流,进行背景光和信号光的校正,收集数据并进行处理,即得脂质体的有关粒径分布情况。
3 结果与讨论
3.1 胆盐对脂质体的粒径大小的影响
所制得脂质体的外观呈规则圆球形,经负染色后,通过透射电镜可清楚地观察到脂质体的脂质双分子层结构,见图1。
图1脂质体的透射电镜照片
该双层膜结构对亲水性和疏水性的药物均可有效的包载。大豆磷脂脂质体的粒径分布情况见图2。
图2脂质体的粒径分布
可见脂质体的平均粒径为217nm,将其10%,50%和90%的脂质体均小于该值的粒径,分别以DV10,DV50和DV90来表示,计算跨距(Span)为0.838,粒径分布范围窄。加入胆盐后脂质体的粒径及跨距变化见表1。
粒径分布范围(跨距)几乎无变化,但脂质体本身的粒径却发生了规律性的变化,在刚开始加入胆盐时,即加入0～0.4mL0.1%的胆盐溶液,胆盐与磷脂的比值小,脂质体粒径有所增大,并持续增加, DV50由247nm增至251nm(胆酸钠)､255nm(脱氧胆酸钠)。随着加入胆盐比例的进一步增加,脂质体粒径呈明显的下降趋势,加入2mL0.1%的胆盐溶液后,脂质体的平均粒径由217nm下降至201nm(胆酸钠)､208nm(脱氧胆酸钠)。
3.2 脂质体的浊度变化
浊度变化是反应脂质体微观结构变化的间接指标,其变化与所加入表面活性剂(胆盐等)/脂质体的相对比例密切相关,见图3。
由图3看出,胆盐加入初期的影响不明显,与脂质体粒径变化规律类似,脂质体的生理盐水混悬液的浊度开始出现升高趋势,随着胆盐比例的继续增加,脂质体混悬液的浊度值逐渐下降。脂质胶团的浊度值变化趋势反映了脂质载体在形成小的混合胶团前,经历了一个或数个结构重排现象,表现为聚集､自乳化和融合等。胆盐与脂质体双分子层间的相互作用,涉及到极性羟基引入到双分子层的疏水性核心,从而引起对磷脂载体的失稳效应,这可解释表1中脂质体的粒径变化情况。与脱氧胆酸钠比较,胆酸钠的第3个羟基可贡献出的额外失稳化作用,使其对脂质体的溶解性作用在后期强于脱氧胆酸钠,表现为浊度下降速率快于脱氧胆酸钠。生理盐水对脂质体混悬液仅起稀释作用,无相关的溶解作用,所以脂质体混悬液稀释仅引起浊度值的持续下降,没有胶团形成过程,且浊度下降快于胆酸钠,但不引起脂质体的溶解。
3.3 胆盐与磷脂载体的作用过程及其机制
表面活性剂被广泛作为生物膜学及脂质体介导的给药系统的分子研究工具。脂质体作为密封的药物贮库系统,近来已广泛用于药物载体使用,脂质体进入生物体内,在有其他破坏脂质体膜的外来分子存在下,考察脂质体包裹物质的释放是较为重要的。胆盐可使脂质体膜上形成小孔,我们在研究过程中亦发现这一现象,见图4。
在低浓度胆盐时,胆盐以二聚物的形式穿插于脂质膜中,胆盐分子周围由6个脂质分子包裹,胆盐可使脂质体内的药物释放。所有的胆盐均可使膜内部紊乱,在高于阀浓度(threshol concentration)时,数分钟内即可使脂质膜出现漏泄,胆盐向脂质膜内､外单层的不对称吸附使得内､外两层中胆盐分子的数目不同,致使膜间产生张力,在超过阀值时,膜出现折叠,胆盐分子通过跨膜转运达到平衡。在胆盐重新分布的过程中,膜上的小孔不仅导致包封物质的释放,还可通过脂质体膜装载相对分子质量小于7000万的药物分子,但不引起脂质载体的溶解性能和脂质体结构的明显改变。因此,胆盐对脂质体包封药物以及对其药物的释放具有重要的调节作用,关于表面活性剂对载药脂质体的释药特性的影响,我们仍在进一步考察中。
