扩展青霉脂肪酶的纯化及氨基酸序列测定

　　作者分离筛选到一株碱性脂肪酶产生菌Penicilliumexpansum WMC20718,并对其所产碱性脂

肪酶进行了分离纯化｡测定了纯酶的相对分子质量､酶学特性和N末端20个氨基酸残基序列｡经计算机联网检索,与300多种已知N末端或全序列的脂肪酶比较,除了Pen. Expansum DSM1994碱性脂肪酶外,未发现有意义的同源性序列｡

1材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 脂肪酶 扩展青霉WMC20718菌株经液体深层发酵,其发酵液经离心､硫酸铵沉淀

和干燥等步骤,制成粗脂肪酶粉｡

1.1.2 试剂 乙腈､丙烯酰胺和N,N 双叉丙烯酰胺 Fluka公司产品;TEMED Bio-Rad公司产品;苯基 –Sepharcse CL-4B､DEAE Sepharose fast flow､Sephadex G-75､G-150､蓝色葡聚糖2000和细胞色素c Pharmacia公司产品;三氟乙酸 Merck公司产品;阴离子LAS､非离子AE09表面活性剂 中科院日化所太原发凯化工公司产品;碱性蛋白酶 浙江海宁酶制剂厂产品(酶活性单位1.0×105U/g)｡

1.1.3 仪器 SX-300快速成像仪 上海四星公司产品;HP-1100型液相色谱仪Hewlett Pachard公司产品;C3冷冻干燥机 美国VirTis公司产品;PHS-2C型精密酸度计 上海雷磁仪器厂产品;476A蛋白质 多肽序列仪 ABI公司产品｡

1.2 纯化方法

1.2.1 硫酸铵盐析 离心上清液加硫酸铵至70%的饱和度,静置4h,再以8000g离心20min收集蛋白质沉淀,溶于少量水中,对含0.5mol/L硫酸铵的20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)透析过夜｡

1.2.2 疏水层析 将透析液上样到已用上述缓冲液预平衡的苯基-Sepharose CL- 4B层析柱

(D1.1cm×30cm)上,用同一缓冲液洗涤4个柱体积,再用含30%乙醇和5%甘油的20m

mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5)进行洗脱,收集活性组分｡

1.2.3 阴离子交换层析 将收集的活性组分在透析袋中用聚乙二醇浓缩后,对50mmol L甘氨酸缓冲液(pH8.6)透析24h,上样到已用同一缓冲液预平衡的DEAE Sepharose fast flow层析柱(D1.1cm×20cm)上,以含NaCl的同一缓冲液进行梯度洗脱｡

1.2.4 凝胶过滤 将经DEAE Sepharose fast flow柱层析得到的高纯度脂肪酶冷冻干燥后,在Sephadex- 75层析柱(D1.6cm×60cm)上以蒸馏水进行洗脱,收集的活性组分冷冻干燥､备用｡

1.2.5 高效反相色谱 酶蛋白的均一性检测在HP-1100型高效液相色谱仪上进行,采用反相Zorbax300SB CN柱｡洗脱液体积流量:1.0mL min;洗脱液:溶剂A,0.1%TFA-H2O;溶剂B,0.085%TFA ACN｡

1.3 其它方法

1.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)PAGE采用不连续垂直板状电泳系统进行,分离胶质量浓度7g/dL.SDS PAGE也采用不连续垂直板状电泳系统进行,分离胶质量浓度15g/dL｡

1.3.2 相对分子质量测定 采用SDS-PAGE和凝胶过滤[9]两种分离体系,分别测定碱性脂肪酶的相对分子质量｡凝胶过滤在Sephadex G- 150柱(D1.6cm×60cm)上进行,洗脱液为20mmol L甘氨酸缓冲液(pH8.6),洗脱速度0.4mL min｡

1.3.3 蛋白质浓度测定 采用Lowry法进行测定,以牛血清白蛋白作标准｡

1.3.4 脂肪酶活性测定 测定方法和试剂配制参见文献,每分钟水解橄榄油产生1μmol L游离脂肪酸的酶量定义为一个脂肪酶国际单位(U)｡

1.3.5 N末端氨基酸序列测定1取5μg纯化后的碱性脂肪酶,上蛋白质/多肽序列仪进行

氨基酸残基序列测定｡

2结果与讨论

2.1 脂肪酶的纯化

预试验结果表明,硫酸铵饱和度为70%时,上清液中仅残留2%的酶活性.在200mL上清液中缓慢加入106g固体硫酸铵(70%饱和度),并不断搅拌至溶解｡静置4h后以8000g离心20min收集蛋白质沉淀,溶于30mL缓冲液中,透析后得到36mL的粗酶样品液｡该样品在苯基

 -Selpharose CL- 4B上进行疏水层析,体积流量为24mL/h,每管体积为4mL,结果如图1所示｡脂肪酶主要分布在第2个峰内(第40至70管)｡通过苯基 –Sepharose CL- 4B的疏水层析分离,可除去大部分杂蛋白质和色素｡

图1 脂肪酶的Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析

图 2 脂肪酸的DEAE Sepharose fast flow柱层析

将疏水层析收集的脂肪酶活性部分在DEAE Sepharose fast flow上进行阴离子交换层析,体积流量为18mL h,每管体积为3mL,洗脱曲线如图2所示｡活性测定结果表明,第42管开始有酶活性,至第47管达到最大值｡进一步用PAGE检测各收集管内蛋白质样品的浓度和纯度,结果见图3｡44~52管内组分呈单一蛋白质条带,而54~60管有3个条带｡将3个条带分别从胶上回收后测定酶活性,结果表明,这3个条带都有酶活性,是理化性质很接近的碱性脂肪酶同工酶｡将42至52管合并,用聚乙二醇透析浓缩至4mL｡

将浓缩液分2次用Sephadex G- 75柱层析进一步提纯,洗脱结果见图4,呈现一个对称的蛋白质吸收峰,样品酶活性测定采用固体琼脂平板法,酶活性与蛋白质吸光度(OD280)呈对应关系｡收集具有酶活性的各管,冷冻干燥后得到纯度较高的粉状脂肪酶,经SDS-PAGE和RP-HPLC检测,均达到了SDS-PAGE和RP-HPLC纯,可用于N末端氨基酸序列测定｡

2.2 脂肪酶的纯化倍数和比活性

WMC20718菌株发酵液经表1各步骤分离纯化后,冷冻干燥得到了比活性为4200U/mg的碱性脂肪酶,纯化倍数18.5,得率48.8%｡

表1 扩展青霉WMC20718碱性脂肪酶的分离纯化

   注:冷冻干酶粉比活性的下降是由于冷冻干燥过程中酶的微量失活所致｡2

.3 N末端氨基酸序列

N末端20个氨基酸残基的序列为:NH2- Ala-Thr-Ala-Asp-Ala-Ala-Ala-Phe-Pro-Asp-Leu-His-Arg-Ala-Ala-Lys-Leu-Ser Ser-Ala ｡将N末端20个氨基酸序列与Jaeger和Yamaguchi等报道的Pseudomonas aeruginosa 和Penicillium camembertii U-150所产脂肪酶的N末端氨基酸序列比较后,未发现有相同之处｡同时经计算机检索与300多种已知脂肪酶的N末端氨基酸序列比较,除了Pen.expansum D S M1994碱性脂肪酶外,未发现有效同源性｡

2.4 相对分子质量测定

分别采用SDS-PAGE和Sephadex G-150凝胶过滤,测得该酶的相对分子质量为27500(图5)和28200(图6),表明该酶以单体形式存在,不存在多聚体｡

2.5 pH值对酶活性的影响

在不同pH值条件下(温度30℃)测定酶活性｡结果表明,该酶的最适pH值为10.0｡另取一定量纯化的酶液与不同pH值的缓冲液等体积混合,30℃保温30min后测定其残余酶活性｡该酶具有较宽的稳定pH值范围,在pH6.5~10.5范围内表现出较好的酸碱稳定性｡

2.6 温度对酶活性的影响

在pH值为10.0条件下,测定了在不同温度下相同酶量的活性｡结果表明该脂肪酶的最适反应温度为30℃｡将相同量的酶在最适pH值条件下,以不同温度处理30min后,30℃条件下测定其残余酶活性｡45℃处理30min仅残留30%的酶活性,但在35℃以下可保留近100%的酶活性｡

2.7 碱性蛋白酶对脂肪酶活性的影响

洗涤剂中碱性脂肪酶及蛋白酶的添加量一般在800~1000Ug,按每升水加5g洗涤剂计,洗涤溶液中脂肪酶和蛋白酶活性在4~5U mL｡实验中将脂肪酶单位控制在5U mL,与不同活性碱性蛋白酶､在不同温度下作用30min后,测定其残余酶活性(以相对酶活表示),结果如图7所示｡随着蛋白酶活性和温度的升高,脂肪酶残余活性有所下降｡蛋白酶活性在10U mL以下对脂肪酶残余活性的影响较小,因此可以认为该酶在有蛋白酶存在的情况下具有良好的稳定性｡

图7 洗涤剂中蛋白酶对脂肪酶活性的影响

2.8 表面活性剂对脂肪酶稳定性的影响

分别将非离子和阴离子表面活性剂AEO9和LAS配成质量浓度为20g/L的水溶液,将脂肪酶于30℃条件下处理30min,测定残留酶活性｡

表2结果表明,阴离子LAS对酶活性影响较大,而非离子AEO9对酶活性无影响,且抵消阴离子LAS对酶活性的影响｡

表2 表面活性剂对WMC20718脂肪酶稳定性的影响

温度､pH值､碱性蛋白酶及表面活性剂等对该纯化脂肪酶活性影响的研究结果表明,该酶与Yuzo等报道的Pseudomonas fluorescens所产碱性脂肪酶的特性相类似,这些酶学特性使得该酶非常适合作为洗涤剂用酶｡相对来说WMC20718脂肪酶的最适作用较低,适合在常温下洗涤,但在耐阴离子表面活性剂等性能上不如P.fluorescens脂肪酶｡

3结论

扩展青霉WMC20718发酵液中除了目的碱性脂肪酶之外,还存在其它蛋白质和杂质｡根据不同蛋白质存在疏水性､电荷和相对分子质量大小等物理性质方面的差异,对脂肪酶进行了分离纯化｡获得高纯度的碱性脂肪酶,研究其物理化学性质,是进一步从分子水平研究该酶的结构与功能的关系､酶结构基因和调控元件的序列分析和改造等必不可少的一步｡研究中测定了纯化脂肪酶N末端的氨基酸序列,为进一步克隆该脂肪酶基因提供了重要的生物信息｡目前,作者正在克隆该脂肪酶基因,目的是将其克隆到米曲霉或毕氏酵母中,期望能进一步提高微生物的产酶能力和改善酶的特性｡

近年来,利用碱性脂肪酶水解脂肪而使其脱离纤维的达到去除污垢的效果,已引起了人们的极大兴趣｡寻找一种在洗涤过程中稳定､高活性的脂肪酶,提高三酰甘油酯的去除率是研究碱性脂肪酶的主要目的之一｡对WMC20718所产脂肪酶的最适温度､最适pH值､耐蛋白酶及表面活性剂等特性的研究表明,该酶适用于洗涤剂中｡

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