罗丹明6G生物探针测定蛋白质

1引言

蛋白质的研究与营养、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运输、遗传、生命的起源和进化等都有密切的关系。测定血清蛋白量及质的改变,对疾病的诊断、疗效的观察提供有价值的数据。荧光应用于蛋白质定量测定是近年来逐渐兴起的分析方法[1~5],由于其干扰小、快速、灵敏度高、准确、实用而受到广泛的关注。某些荧光染料在一定条件下形成二聚体,如吖啶红[4]、吖啶黄[6]、荧光素[7]等,罗丹明6G还少见报道。本文中利用罗丹明6G在十二烷基磺酸钠的存在下形成二聚体,蛋白质的定量加入可以调节这一平衡,拟定测定蛋白质的分析方法。

2实验部分

2.1 仪器与试剂 RF-540荧光分光光度计(日本岛津),λ-17紫外-可见分光光度计(P-E公司),P

HB-4型酸度计(上海雷磁仪器厂)。

牛血清蛋白(BSA,中国科学院化学研究所)相对分子质量按65000计,以50g LNaCl水溶液,配成100mg L,使用时临时稀释。罗丹明6G溶液:1×10^-4mol L。十二烷基磺酸钠溶液(SDS):1×10^-4mol L。Tris-HCl缓冲溶液(pH):7.48。氯化钠溶液:0.1mol L。所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。

2.2 实验方法 在一系列10mL比色管中分别加入0.5mL罗丹明6G溶液(1×10^-4mol L),加入0.5mL1×10^-4mol LSDS,用Tris-HCl溶液调节pH=7.48,加入0.9mL氯化钠溶液(0.1mol L)以及一定量BSA溶液并摇匀,放置5min后,用354nm波长光激发,在波长553nm处测定发射光强度,同时作空白实验。

3 结果与讨论

3.1 可见光谱特征  罗丹明6G的最大吸收峰在525nm处,随着SDS的加入,最大吸收峰红移到534nm处,峰高随着SDS浓度的增大而减小(见图1)。

3.2 荧光光谱特征 随着SDS表面活性剂的加入,罗丹明6G形成二聚体,荧光强度明显降低。蛋白质的加入可使二聚体解聚,荧光强度回升(图2)。据此拟订测定BSA的分析方法。

C_6G=5×10^-6mol L C_SDS=5×10^-5mol L,pH=7.48①②C_BSA=0 ③④C_BSA=.0mg L

3.3 最佳SDS浓度的确定 在一定浓度范围内,体系的荧光强度随着SDS的加入而降至最低值,再加入SDS时荧光强度升高(图3),由图中可以看出,荧光强度最低时SDS时的浓度为形成二聚体的最佳浓度。

C_6G=5×10^-6mol L C_SDS=1×10^-4mol L,pH=7.48,C_BSA=1.0mg L

3.4 最佳C_6G/C_SDS的确定 实验结果发现相对荧光强度随C_6G/C_SDS的不同而不同,C_6G=5×10^-6mol L时相对荧光强度最大,灵敏度最高,与BSA的浓度线性关系良好,相对应的SDS浓度为1×10^-4mol L。

3.5 最佳酸度的确定 pH值对C_6G /C_SDS的影响最小,在一定pH范围内可以不考虑,对6G-SDS -BSA的影响较大,体系的荧光强度随pH的增加而增加,在pH为7.48时体系的荧光强度最大。见图4。

C_6G=5×10^-6mol L C_SDS=5×10^-5mol L, C_BSA=1.0mg L

C_6G=5×10^-6mol L C_SDS=5×10^-5mol L,C_BSA=1.0mg L,pH=7.48,_CNaCl=0.1mol L

3.6 稳定性实验 该体系反应加快,于室温下反应5min荧光强度即可达到最大,0.5h内荧光强度不变。

3.7 试剂加入顺序的影响 试验了试剂的不同的加入顺序,以6G-SDS-BSA此顺序的荧光强度最大且比较稳定。

3.8 盐效应的影响 随着NaCl的加入可使R6G-SDS-BSA体系的荧光增大,但考虑到灵敏度,如果NaCl的浓度太大,则空白试验的荧光太高,灵敏度低,所以测定体系NaCl的浓度为0.009mol L。

   6次测定平均值。

3.9 共存物质的干扰 对测定体系干扰较大的是Fe³⁺,Ca²⁺和部分氨基酸,在实际测定血清样品时稀释500倍,这时对测定的影响很小,其他的干扰较少,所以本法选择性较好。

3.10 工作曲线的线形范围 在以上最佳条件下测定蛋白质,工作曲线线形回归方程为F=8.304+38.02C,线形范围为0~10mg L,相关系数0.997,对5.0mg L的BSA的11次测定结果为4.9mg L,相对标准偏差为2.1%,检出限为0.1mg L,说明本法准确可靠。

3.11 血样的测定 取新鲜血浆,处理后将血清样品稀释500倍作为蛋白质测定的工作液,按实验方法测定荧光强度,分析结果见表1。回收率在98%~103%。与考马斯亮兰法(CBB)测定结果一致。

参考文献:

[1]Brodford M M A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein vtolizing the principle of protens-dye dinding[J].Aanl Biochem,1976,72:248~249.

[2]Saito Y, Okazaki Y, Sano S, et al A sensitive spectrofluorimertic method for the determination of human altrumin with chrome-egurols [J].Chem-Pharm Bull,1986,34(7):2880~2884.

[3]Ma C Q,Ci K A, Tong S Y .Determination of proteins by fluorescence quenching of arythrosin[J] Ana Chim Acta,1996,333:83~86.

[4]陈鸿琪,夏 闽.荧光染料吖啶红作测定蛋白质的生物探针[J].理化检验(化学分册),2001,37(2):53~55.

[5]朱 铿,童沈阳.荧光黄与蛋白质相互作用的研究[J].高等学校化学学报,1996,17(4):539~542.

[6]Hongman Zhang, Xiangqun Guo, Yibing Zhao, et al Study on the dimer-monomer equilibrium of a fluorescent dye and its applica –tion in nucleric acids determination [J].Anal Chim Acta,1998,361:9~17.

[7]陈鸿琪.阴离子染料荧光素生物探针测定蛋白质[J].西北师范大学学报(自然科版)2000,6(4):61~64.