腺苷是核酸代谢途径中的主要因子之一,是酶反应和细胞修复所需要辅助因子的组成部分,具有广泛的生理和药理作用。其生产意义主要有:(1)临床用药,治疗心律不齐、风湿性心脏病,心肌炎等;(2)抗病毒、肿瘤,以及ATP、CoA等多种药用核苷酸类物质的前体。目前国内腺苷生产严重不足,而且用的是生产成本很高的化学法或酶法。发酵法生产腺苷的研究有利于生产成本的降低[2]。枯草杆菌内核酸的合成代谢途径如图1:
图1 枯草杆菌嘌呤核苷酸合成途径
1.PRPP 转酰胺酶；2. IMP环化脱水酶；3. SAMP合成酶；4.SAMP裂解酶；5.AMP脱氢酶；
6. IMP脱氢酶；7.XMP 氨化酶；8.GMP还原酶；
由上图可看出由于Ｂ.subtilis 中存在酶5和酶8使得通常的核苷酸分枝合成途径成为环形途径,同时AMP和ATP等对酶1和酶3有强烈的反馈抑制作用,因此在正常情况下虽有酶9,但菌内的AR含量及浓度均很低。而在使酶6缺陷后,如又能解决反馈抑制,则AR的生成将有显著提高。十六烷基三甲基溴化铵能改善细胞的渗透性,有利于AR的及时分泌,使胞内的AMP浓度下降,不失为解决反馈抑制的一个可行途径。
1材料与方法
1.1 菌株
腺苷产生株Ｂ. Subtilis 黄嘌呤缺陷型。
1.2 培养基
葡萄糖, 1.0;
酵母粉, 1.0;
蛋白胨, 0.4;
牛肉膏, 1.4;
琼脂, 1.8;
pH 7.0
葡萄糖, 2.0;
酵母粉, 1.5;
蛋白胨, 1.0;
玉米浆, 1.0;
尿素, 0.3;
NaCl, 0.25;
pH 7.0
尿素,0.375;KH2PO4,0.5;NH4Cl,2.0;酵母粉,3.0;玉米浆,3.0;CaCO3,2.0;葡萄糖,10.0;MgSO4·7H2O,2.0(分消);pH6.6。
1.3 主要化学试剂
十六烷基三甲基溴化铵(上海伯奥生物科技有限公司)
1.4 分析方法
用751型分光光度计,测定培养液OD580ｎｍ的光密度(稀释5倍)
精密pH试纸(5.5～9.0)
吸10μL发酵上清液点样,上行走纸层析3h。剪下最前面一个紫外吸收斑点,用4ml0.01mol/LHCl
2结果与讨论
2.1 摇瓶发酵
据报道,枯草芽孢杆菌在500ml摇瓶内置20ml发酵培养基,往返式摇床120ｒ/min,温度
图2 腺苷产率、糖浓度、菌密度与发酵时间关系
2.2 添加CTAB的时间对AR产率的影响
图3 添 加时间对产率的影响
我们使用的枯草芽孢杆菌黄嘌呤缺陷型菌株经多次纯化后,对表面活性剂敏感。在4%CTAB下,试验时间范围是12～84ｈ,得最佳添加时间为发酵60ｈ左右。
2.3 添加CTAB的量对产率的影响
试验范围2.0%～6.0%,得CTAB最佳添加量为4.0%。
图4 添加量对产率的影响
2.4 添加Tween60对CTAB的辅佐作用
CTAB会使发酵过程中产生大量泡沫,在4%CTAB时考察消泡剂Tween60的作用,结果显示在1%时对产率稍有提高。
图5 Tween60对产率的影响
CTAB是一种阳离子表面活性剂,其阳离子属碱性基团,而革兰氏阳性菌细胞壁表面酸性基团多于碱性基团,因此CTAB对枯草杆菌这种革兰氏阳性菌有很强的吸附作用。表面活性剂结构中都具有疏水性基团和亲水性基团,当CTAB透过细胞壁后,其疏水性基团十六烷基能与细胞膜中的脂质结合,而其亲水性的阳离子可与膜中的蛋白质结合,从而增加膜的流动性。值得注意的是ＡＲ具有使细胞膜上的腺苷酸环化酶(AC)活性及膜的流动性降低的生理作用,因此增加膜的流动性就显得更具意义了。
Ｂ.subtilis 黄嘌呤缺陷型菌株在接种后要经过一个较长的诱导期,约18ｈ,由于表面活性剂对细胞壁和细胞膜有损伤作用,而细胞壁与细胞膜的完整性对细胞分裂有重要影响,因此诱导期加入CTAB将会使对数增殖期的前体细胞不足,从而导致稳定期菌数的严重不足,使产率降低。在对数增殖期(18～48ｈ)加入CTAB会直接抑制细菌的增殖,如在该期的前期加入,也会引起稳定期菌数的不足,影响产率,如在该期的后期加入CTAB,由于已有相当规模的菌数,仍可轻度的提高产率,当处于稳定期后,细胞数保持恒定,该期是合成目的产物的旺盛时期,此时加入CTAB能使ＡＲ快速移至胞外,反馈抑制得以缓解;而到了衰退期再加CTAB就显得意义不大了。
由于表面活性剂是一类对细胞有损伤作用的物质,CTAB能使膜中的蛋白质变性,在量大时季铵盐具有杀菌的作用,因此发酵中须选择最佳的添加量。
在添加CTAB后,发酵过程中会产生大量的泡沫,这会影响通气量,而氧溶量是发酵成功的一个关键因素,如同时添加适量的消泡剂Tween60可有效控制泡沫的产生,但由于Tween60本身也是个对细胞膜有一定损伤作用的物质,因此CTAB和Tween60的相对用量也必须作出选择,当Tween60用量超过2%时,就会降低AR的产率。
参考文献
[1] Kennedy. A I Jzerman. Adenosine And ATP from rector structure to clinilication . Trends in harmacological science ,1994;15:311～312
[2] 王文仲.应用微生物学,中国医药科技出版社,1993;217～225
[3] 乔宾福.微生物产生核苷和核酸,工业微生物,1998;28(1):22
[4] K. haneda et al . J. Fermatation Technol .1987;65(2):145～151
[5] 西山撤Nippon Nogei Kagahu Kaishi.1994;68(4):809～814
[6] 黄彬汉.表面活性剂在工业微生物领域中的应用,表面活性剂工业,1986;7(2):37～39
[7] 西山撤Nippon Nogei Kagahu Kaishi .1993;67(5):843～847
[8] 赵章楣.季铵盐型阳离子杀菌剂的近期发展,表面活性剂工业,1991:11(4);2～4
[9] 李平风等.腺苷对膜通透性的影响,北京医科大学学报,1991;23(2):103～105
[10] Nippon Nogei Kagahu Kaishi,1995,69(4):1341～1347
