糖酯是一种广泛用于食品､化妆品和药品中的表面活性剂。相对于其他类型的表面活性剂,糖苷脂肪酸酯具有以下优点:(1)它是一种非离子型表面活性剂,具有无毒､无色､无味､生物可降解等优良特性;(2)它是一种极好的乳化剂且易于消化;(3)它是由可再生资源经生物催化剂催化合成的。此外,有研究报道糖酯具有抗肿瘤､抑菌和杀虫等功能,而且适量食用糖苷不饱和脂肪酸酯能降低血液中胆固醇的含量及冠心病的发病率。国外最新报道不饱和脂肪酸糖苷酯可用于皮肤化妆品中。传统的糖苷脂肪酸酯合成方法是化学法。合成时一般会引起糖焦化,产物不纯,副产物较多,而利用脂肪酶在非水相体系中催化合成糖苷脂肪酸酯可有效克服以上缺点。近年来国外在此方面已进行了一定的探讨。本文对无溶剂体系脂肪酶生物催化合成油酸糖苷酯进行了系统的研究,确定了最适酶促酯化反应条件。
1 实验部分
1.1 材料脂肪酶:Novozym435(来源于Cand id aantarcticaB型脂肪酶,固定于阴离子树脂上),酶活在60°C时为7000PLU/g(Propy1 Laurate Units); Lipozyme RM(来源于Mucor miehei)酶活在70°C为5BAUN/g～6BAUN/g(Batch Acidolysis UnitsNovo),北京Novo Nordisk公司赠送。Porcine pancreaticLipase(PPL),酶活110U/mg;Cand ida cylindracea lipase(CCL),酶活1400U/mg;Sigma Chemical Co.USA;油酸(纯度90%), Aldrich USA。其余试剂均为分析纯。
葡萄糖､甲基葡萄糖苷由上海化学试剂公司购得,乙基葡萄糖苷和丙基葡萄糖苷均由自己合成。
高温摇床HZ-9612型,江苏太仓科教器材厂。
1.2 实验方法
1.2.1 无溶剂体系中酶的催化反应 在敞口小三角瓶中加入3mmol油酸和2.5mmol糖苷,预热至相应温度后加入一定量的酶,高温摇床上反应12h～48h,转速为200r/min,定时取样。
1.2.2 产物的提取与分析 反应混合物冷却后,加入10mL氯仿溶解产物,过滤除去固定化酶。用薄层层析(TLC)分析和分离所得产物。TLC分析表明乙基葡萄糖苷油酸单酯的Rf值为0.25,乙基葡萄糖苷油酸二酯的Rf值为0.33,而未反应完全的油酸的Rf值为0.83,糖苷在此展开体系中基本没有迁移。TLC展开剂:三氯甲烷∶甲醇∶水∶冰乙酸=90∶8∶1∶1(V/V),显色剂是φ=0.2的硫酸溶液,105°C加热15min。自制薄层层析制备板在上述展开体系中分离反应产物,刮下相应条带溶于氯仿中,再真空干燥得产物乙基葡萄糖苷单酯纯度约为95%,可用于质谱分析(中科院上海有机所分析中心检测)。HPLC检测:反应结果采用岛津HPLC-SCL检测系统,色谱柱为C18反相柱,流动相为甲醇∶水=95∶5(V/V),检测温度为40℃,流速1mL/min,进样量为10μL,示差检测器酶催化反应初速率的计算方法见文献。
2 结果与讨论
2.1 不同来源酶的选择
比较4种常用的脂肪酶在无溶剂体系中催化糖和糖苷与油酸的酯化反应,反应条件为:5mmol油酸和5mmol乙基葡萄糖苷,温度70°C,摇床转速200r/min,反应时间为24h,只改变酶,观察不同来源酶对油酸乙基葡萄糖苷酯合成的影响,结果见表1。
由表可知CCL和PPL均不能催化此反应,Novozym 435和Lipozyme则可催化此反应。Novozym 435催化能力明显优于Lipozyme,它可使油酸完全转化,且选择性也高。这可能与底物糖苷的结构有关。由上可知,以Novozym 435作为催化剂在无溶剂体系可有效地催化合成油酸糖苷酯。以下实验皆采用Novozym 435作为催化剂。
2.2 糖苷烷基对反应的影响
糖苷是此酯化反应的一种底物,糖苷的不同会显著影响此催化反应的进行。在有机相中酶法合成糖酯的主要障碍是几乎所有的单糖和二糖都不溶于大多数有机溶剂中。极性强的溶剂吡啶和二甲基亚甲酰胺曾被用于催化此酯化反应,然而这些极性溶剂会破坏酶的结构,引起酶活的迅速丧失,而有机溶剂的毒性使合成的产物不能用于食品､化妆品和药品。解决方案之一是以糖苷取代原来的单糖和蔗糖,因为糖苷的憎水基团可使其易溶于己烷和叔丁醇中,甚至可直接部分溶于脂肪酸中。但不同的糖苷因其所带基团的不同,在反应中也表现出不同的结果。为此在其他反应条件恒定的情况下,只改变糖苷,观察其对催化反应结果的影响,见图1。
由图1可见,葡萄糖和甲基葡萄糖苷无明显反应,乙基糖苷和丙基糖苷与油酸反应较完全。这主要是在无溶剂体系中乙基糖苷和丙基糖苷与油酸有一定的互溶性,能促使酯化反应的进行。而葡萄糖或甲基葡萄糖苷只有在以吡啶作溶剂时才能与脂肪酸发生酯化反应。由此可见,无溶剂体系要明显优于有机相体系,一是不引入有毒有机溶剂,二是减少了有机溶剂对酶活的损伤。另外由图中也可看出以丙基糖苷作为糖原,反应速率要高于乙基糖苷,这可能是由于两者在结构上不同所引起的。
2.3 初始水分的影响
水分对酶催化反应是必要的,它在维持蛋白的活性构型方面起着重要的作用。在其他条件不变的情况下,向反应体系中加入不同量的水,观察其对催化反应的影响。水在此反应中所起的作用表现为两方面,一为溶剂作用,二为改变反应平衡的作用。而水对酶的影响主要表现为改变酶的三维构象,从而改变酶的选择性,甚至改变酶的催化特性。
由图2可看出,随初始水分的增加,反应初速率也相应增加;但当wH2O初>0.04时,反应初速率又随水分的增加而减小。其主要原因是:(1)水分的适度增加可降低乙基葡萄糖苷的粘度,相应减少了外扩散的影响,且在初始阶段酯化反应的逆反应水解反应表现不明显;(2)当wH2O,初>0.04时,一方面在高温下酶活开始下降,另一方面逆反应也相应增强,结果是反应初速率相应减小。
反应24h后终止反应,检测油酸转化率,最终转化率与初始水分的关系见表2。
初始水分含量高的反应最终转化率低。这主要是水解反应随反应的进行而表现得越明显,并最终影响油酸的转化率。需要指出的是虽然此反应是在高温敞口的三角瓶中进行的,反应过程中既有水分的积累也有水分的蒸发,但在70°C下水分蒸发不足以消除初始水分对最终转化率的影响。
2.4 酶浓度的影响
提高酶浓度可减少反应时间,但一般会增加操作成本。
由图3可知随酶浓度的增加油酸转化相应加快。在反应进行8h后,油酸已基本转化完全。但此时继续延长反应时间油酸糖苷单酯的含量会发生变化,最后以w酶=0.05的单酯含量最高,达86.55%,酶浓度对生成油酸糖苷单酯的影响见表3。
酶浓度高对油酸糖苷单酯的生成不利,这可能是反应速率提高后,水来不及挥发而被酶吸收,从而改变了酶的构象,使反应向合成二酯和三酯的方向转移;当延长反应时间后,体系中的水分会逐渐减少,反应又会向合成单酯的方向进行。所以在本实验条件下,为保证油酯糖苷单酯的得率最高,酶的最适浓度为w酶=0.05。
2.5 温度的影响
其他条件不变,反应温度为60°C～90°C,实验结果见图4。
初速率随温度增加几乎成指数增长,原因是:(1)温度的升高可增大两底物间的互溶;(2)温度的增加,底物乙基葡萄糖苷的粘度降低,外扩散阻力减小。
初速率的变化受水分蒸发的影响,温度越高,水分蒸发越多,反应自然向酯化方向偏移,所以高温条件下油酸很快被完全转化。温度对酯化反应选择性的影响见表4,温度越高单酯的选择性也越高,这主要是体系中酶的构象与反应中的水分有关,水分越少越有利于单酯的合成;而温度越高体系中水分蒸发越快,则反应中残余水分越少。这基本上与Adel-horst的实验结果一致,在其减压反应体系中单酯的含量高达95%。
2.6 固定化酶Novozym 435的稳定性
固定化酶的回收和重复利用是酶法合成所必须考虑的重要因素。检测Novozym435在无溶剂反应体系中的稳定性,每批在80°C下反应24h检测油酸的转化率,共8批,每批反应结束后,乘热吸取上层产物,再加入相同量的底物继续反应。8批反应后,油酸的转化率仍可达95%以上,表明Novozym 435在此反应条件下有良好的操作稳定性。
2.7 质谱分析
酶法合成的乙基葡萄糖苷油酸单酯,通过制备硅胶板分离可得纯度为95%的单一产物,此产物作质谱分析。数据显示分子离子峰有m/z=495.4[M+Na]+和m/z=511.4[M+K]+,正好为乙基葡萄糖苷油酸单酯的相对分子质量。
3 结 论
在无溶剂体系中以固定化酶Novozym 435催化合成糖苷脂肪酸酯。最适反应条件为:温度80°C,初始水分为0,w酶=0.05,反应时间为12h。固定化酶可重复使用8次以上,在糖苷稍过量的情况下油酸的转化率可达100%,而单酯的合成与体系中的水分相关,本实验中单酯的最高含量可达88%。
