辣根过氧化物酶在表面活性剂膜中的直接电化学

      1 引  言

研究氧化还原蛋白质与电极之间的电子传递过程具有重要意义。一方面它为理解生物电化学和生物代谢过程提供有价值的信息,另一方面,利用电极探讨氧化还原蛋白质与底物分子之间的电子传递过程,为制备生物传感器提供实验基础。

HRP含有辅基血红素,它是研究过氧化物酶的结构､动力学和热力学性质的代表。另外,HRP修饰电极广泛运用于分析过氧化氢､有机过氧化物､酚类化合物､芳香化合物以及一些环境污染物。近几年,利用各种材料的电极对HRP的直接电子传递过程及催化性能进行了深入的研究,但HRP修饰电极的催化电子传递机理仍存在着争议。而且只有少数文献描述了酶中Fe(Ⅲ)/FeⅡ氧化还原对的电化学行为。原因是HRP中的电活性中心与电极之间的电子传递速度很慢。因此,研究酶的固定化材料和方法､使酶具有适宜的环境､保持其活性､具有良好的取向以加速电子传递过程是当前十分活跃的研究课题。表面活性剂膜具有与生物体磷酯膜十分近似的结构。因而可能成为研究蛋白质的电化学提供良好的微环境,为构造生物传感器提供新型材料。

本文研究了在表面活性剂膜内的HRP的电化学性质。实验结果证明:(1)表面活性剂是一种固定酶的理想材料;(2)这种体系可能构造第三代生物传感器。

2 实验部分

2.1 试剂和仪器

HRP(Grade Ⅱ,德国Boehringer公司),使用时未经提纯。双十二碳烯基溴化二甲基铵(DDAB,Aldrich公司),双十四酰基磷酯酰胆碱(DMPC,Sigma公司),双十六烷基磷酸(DHP,Fluka公司)。其它化学试剂均为分析纯,所有溶液用Milli-Q水配制而成。缓冲溶液(离子强度为0.1)配制:酒石酸盐pH3.0～6.0;磷酸盐pH7.0～8.0;硼砂pH=9.0～10.0;磷酸盐:pH=11.0。电化学测量使用计算机控制的Autolab电化学系统(荷兰Eco.Chemie公司)。

2.2 实验方法

2.2.1 电极的修饰 表面活性剂DDAB(10mmol/L),DMPC(10mmol/L)和DHP(2.5mmol/L)的悬浊液,超声波振荡形成分散液。等体积的表面活性剂分散液和HRP(165g/L)的磷酸盐溶液混合。取10μL该混合液平铺于电极表面,空气干燥约12h。制得的修饰电极分别表示为:DDAB/HRP,DMPC/HRP,DHP/HRP。

2.2.2 电化学测量 电化学池由参比电极池和电化学反应池(体积约400μL)两部分构成,其间由鲁金(Lugging)毛细管连接。参比电极为饱和甘汞电极(vs.SCEK401,Radiometer)。铂丝网为辅助电极,工作电极为EPG(LeCarbone-Lorraine),电化学面积由Randles-Sevocik方程求得为0.075cm²。每次实验前,EPG电极用金相砂纸磨平,在人造毛绒上以Al₂O₃(粒度0.015μm,BDH)悬浊液抛光成镜面。超声波震荡清洗后,进行电极修饰。实验过程中在支持电解质溶液中通N₂除O₂。

3 结果及讨论

3.1 辣根过氧化物酶的直接电化学

DDAB/HRP,DMPC/HRP,DHP/HRP膜修饰电极于磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0)中测得的CV曲线为图1所示。

均呈现一对氧化还原峰。峰的形状基本对称而且氧化和还原峰高大致相等。而不含HRP的表面活性剂膜电极不产生法拉第电流。所以此氧化还原峰是HRP的电活性中心与电极之间进行电子交换的结果。

半波电位(表1)与用电势法测定HRP血红素Fe(Ⅲ)/FeⅡ氧化还原对的电位值(E=-0.271V,PBSpH7.0,T=30℃)相近。

随着扫描速度的增加,阳极峰与阴极峰的电位差值(ΔEp)有微小的改变。ΔEp大于表面过程的理论值(ΔEp=0mV)。这种结果的产生可以归于HRP的构象效应。即:HRP分子较大且形状不太规则,电活性点埋藏较深。另外电场力的影响,导致在电位扫描过程中,引起电荷分布和空间位置的变化,使ΔEp偏离理论的估算值。但当扫描速度高于1V/s时,其峰电流与扫描速度成正比例,线性方程分别为:阴极峰电流:y=-0.779+9.687x,r=0.9837;阳极峰电流:y=-0.642+9 628x,r=0.9739。表明该电化学反应为吸附在电极表面的HRP与电极之间的电子交换过程。

在较宽的pH范围内(pH3.0～11.0)氧化还原峰随着pH值的增加负移,且形状微有变化。但均可得到可逆､重现性良好的循环伏安图(图2)。

本实验测得酶中FeⅢ/FeⅡ电对的电位值比报道值(E=-0.50Vvs.SCE)正移,而且随着表面活性剂所荷电荷由正到负而负移。原因是HRP分子外表面分布着许多带电的氨基酸残基,在中性pH条件下带负电荷(等电点pI4.2)。所以荷正电的DDAB通过长碳链的侵入和静电作用,有利于HRP的活性中心与电极之间的电子交换,而且氧化还原电位随[H+]的增加而正移。结果表明:(1)表面活性剂中长碳链能侵入HRP分子中从而缩短电极与酶活性中心的电子转移路径。(2)在电极表面,酶的活性中心有良好的取向。(3)荷电的表面活性剂为酶的电子转移过程提供特殊的微环境。

当v<1V/s时,电流与扫描速度无线性关系,i_pc/i_pa远离1,当v<0.2V/s时,阳极峰消失(图3)。

这种现象表明有一受动力学控制的电极反应发生。原因是EPG电极表面的含氧基团在较负电位下,产生超氧负离子自由基(O^-₂),而表面活性剂膜又增加了电极表面的憎水性,延长了O^-₂存在的时间。其反应历程可表示如下:

3.2 辣根过氧化物酶催化还原H₂O₂

HRP催化还原H₂O₂过程可表示如下:

HRP(Fe²⁺)+H₂O₂  →化合物I+H₂O

化合物Ⅰ+e^-+H⁺→化合物Ⅱ

化合物Ⅱ+e^-+H⁺→HRP(Fe²⁺)+H₂O

在H₂O₂存在下,固定于电极表面的HRP(Fe²⁺)可以全部转化为其氧化态化合物Ⅰ。而化合物Ⅰ能被直接或有媒介体帮助下,经过中间过渡态化合物Ⅱ,还原为HRP (Fe²⁺)。无H₂O₂时,只有酶中FeⅢ/FeⅡ的氧化还原峰。当加入H₂O₂后, FeⅢ/FeⅡ电对峰消失,在-0.291V处,出现阴极峰,此峰表示了酶催化H₂O₂还原的过程(图4)。

当H₂O₂的浓度较低时,峰电流的大小与H₂O₂的浓度呈线性关系(表2)。

随着H₂O₂的浓度增加,峰电流不再按正比例增加,而是趋向极限值,其后峰电流反而降低。其结果与高浓度还原剂存在时,HRP的活性降低是一致的。该电极置于PBS中保存在冰箱里(4℃),一周内所测电流只下降7%。

4 结  论

表面活性剂膜为研究酶与电极之间的电子转移提供了良好的微环境,为固定化酶从而制备生物传感器提供了新的材料和手段。表面活性剂固定HRP于EPG电极表面,实现了直接电化学,并对H₂O₂具有较强的催化活性,为构造第三代生物传感器,应用于H₂O₂､葡萄糖､胆固醇的分析提供广阔的应用前景。