尽管现代防腐剂､抗微生物试剂有所发展,但是,化妆品的微生物污染仍时有发生,尤其是绿脓杆菌的问题颇多,这种假单细胞菌属细胞通常是普遍存在,且适应性强。它以化妆品和表面活性剂的某些组分为食物,对外界变化如温度､PH值等有极大的抵抗力。假单细胞菌属可以适应多种防腐剂,这正是化妆品和表面活性剂受污染的主要原因。污染的途径有时是消费者自身的滥用,但更主要是发生在化妆品的生产和包装环节上。关于微生物对防腐剂产生抵抗性的机理人们知之甚少,一种可能的机理是:微生物对经常放置于其中的防腐剂的新陈代谢能力是逐渐变化的,它以正常的代谢使防腐剂解毒。因此,必须找到一种新的防腐剂来替代原有的防腐剂,从而保证化妆品和表面活性剂免受微生物的污染。
1 分析方法和原料
1.1 原料
1.1.1 防腐剂和药品 甲､丙基对羟基苯甲酸酯-美国药典级;其它药品为分析纯,见表1。
1.1.2表面活性剂 组分如下(质量百分比%):月桂基硫酸铵17.5;月桂基硫酸钠17.5;椰子油二乙醇胺3.0;椰子油酰胺基丙基甜菜碱3.0;柠檬酸0.25;甲基对羟基苯甲酸酯0.2;水58.15。pH值范围6.5—6.8。该产品使用ATCC标准微生物检测达到美国药典标准。
1.1.3 微生物菌体 美国培养的ATCC第9027号绿脓杆菌,用大豆酪蛋白消化媒体作为标准菌种,它是在原始PEIY培养皿中分离出来,用大豆酪蛋白消化媒体培养。
1.2 分析方法
1.2.1 甲基､丙基对羟基苯甲酸酯的定量分析 甲基､丙基对羟基苯甲酸酯用高压反相液相色谱法测定,仪器为WM6000型液相色谱系统,用0.25×25cm不锈钢柱体,外用ODS-C-18材料包装,流动相为甲醇水溶液(醇∶水=65∶35),对羟基苯甲酸通过紫外光谱在254nm处的吸收峰谱线测定。
1.2.2 微生物分析 存活的生物体的浓度要通过使用标准的需氧塔板技术和一系列胰蛋白酶酱油琼脂的稀释液来测定。从原始需氧塔板中分离出来被污染的生物体,使用一种适用于肠道细菌的分析轮廓指数的方法对其进行阳性分析,然后将它们培养36～48小时后测定其生物化学反应的数量和种类。
2 实 验
2.1 对羟基苯甲酸酯的化学稳定性
甲､丙基对羟基苯甲酸酯的化学稳定性是在一个能间歇生产表面活性剂的无菌实验室中测定,每批样品分三份,分别在50℃､27℃､25℃下存放28天,用高效液相色谱分析方法分别测定第一天､三天后､七天后､十四天后､二十八天后样品中对羟基苯甲酸酯的数量。(表1)
2.2 微生物免疫实验
在实验室调配两种表面活性剂样品,其中一份投放对羟基苯甲酸酯防腐剂,另一份不投放,再分别向单个样品中注入ATCC第9027号绿脓杆菌､“WILD”绿脓杆菌或仍保持无菌控制状态。然后把所有样品分别在37℃､25℃培养菌种保持28天,并且分别在培养前､第3､7､14､28天时,分析对羟基苯甲酸酯的浓度和存活生物体的数量(图1､2)。
2.3 防腐剂能力测试
准备两种不含有对羟基苯甲酸甲酯或丙酯的表面活性剂样品,再分别向两种样品中加入结构与对羟基苯甲酸酯防腐剂相近的各种化合物0.3%(质量百分比),分别在37℃､25℃接种培养28天,并且在培养开始前､第3､7､14､28天时分别测定塔板数,从而测出存活生物体的数量。
3 结 果
3.1 对羟基苯甲酸酯的化学稳定性
对羟基苯甲酸甲酯和丙酯在加速条件下化学稳定性的研究表明,样品通过在培养28天后,两种物质在样品中的含量没有明显变化。
3.2 微生物免疫实验
在本实验中,注入ATCC绿脓杆菌后,样品中对羟基苯甲酸甲酯和丙酯的含量在25℃､37℃､50℃下没有明显减少,样品塔板数表明,培养7天无存活生物体。注入经过分离的“WILD”绿脓杆菌的样品,菌种大量繁殖,对羟基苯甲酸酯的含量明显减少(图2);相对应的无菌控制样品中,即不含有对羟基苯甲酸酯的样品,在注入实验生物体后,菌种大量繁殖。
3.3 防腐剂效能实验
此实验试图表明生物体对对羟基苯甲酸酯防腐剂的明显抵抗能力与对羟基苯甲酸酯的独特的化学结构有某种关系。在以上所有化合物中,除了两种4-乙酸基苯甲酸酯以外,实验中所使用的全部化合物都对ATCC型绿脓杆菌起到有效的防腐作用(表2)。
注入“WILD”型绿脓杆菌的样品,当它们与对羟基苯甲酸甲酯､对羟基苯甲酸丙酯､4-羟基苯甲酸､4-乙酸基苯甲酸､4-乙酸基苯甲酸甲酯等一起贮藏时都能观察到有大量微生物生成。但当它们与3-羟基苯甲酸､2-羟基苯甲酸甲酯或苯甲酸一起培养,7天之后没有任何生物生长现象。
3.4 色谱研究
对最初被“WILD”绿脓杆菌污染的样品进行光谱分析表明,所研究的两种化合物在停留时间上与4-乙酸基苯甲酸甲酯和4-乙酸基苯甲酸丙酯相似,但浓度非常低,无法准确测量。如图3.
保留时间(min)
图3 接种混合物样品色谱(“wild”绿脓杆菌)图中:A为对羟基苯甲酸甲酯;B为对羟基苯甲酸丙酯;C为4—乙酸基苯甲酸甲酯
4 讨 论
化妆品工业通常采用美国专利的微生物免疫检测,注入美国专利的标准菌体或ATCC菌体。当出现微生物或防腐问题时,检测方法仅涉及微生物方法学和使用技术标准技术,而没有化学检测。在本实验中我们感兴趣的是,看能否用化学方法检测到被污染物中防腐剂的变化。化学分析与微生物免疫试验的结果所使用的两种生物体有很大的不同,虽然从生物化学角度进行分类时,它们都属于P-铜绿菌属,注入了“WILD”绿脓杆菌的样品中对羟基苯甲酸甲酯或丙酯的浓度明显减小,在这些样品中,“WILD”绿脓杆菌能够迅速生长,同时对羟基苯甲酸甲酯或丙酯的浓度却在28天后大约减少了30%。可ATCC绿脓杆菌标准液与对羟基苯甲酸甲酯､丙酯混合后,该酯没有变化,微生物也没有生成。
为了了解绿脓杆菌能够减小对羟基苯甲酸酯浓度的机理作了一系列防腐效能实验,实验中所用的物质与对羟基苯甲酸酯的结构相似,用这些化合物来测定在含有标准ATCC和“WILD”绿脓杆菌情况下防腐剂的活性。实验中发现-OH在苯甲酸酯的对位时,微生物可以生长;而-OH在苯甲酸和苯甲酸酯的邻位和间位时绿脓杆菌不能生长,从而可以得出结论:微生物能够代谢-OH在对位上的苯甲酸酯。
在此研究中发现,绿脓杆菌可能使对羟基苯甲酸酯乙酰化或使对位羟基与苯环共轭,因此降低了它们的活性,因此使之钝化。而绿脓杆菌不能使邻､间位衍生物钝化的原因可归结为位阻现象,酯基团的保护使-OH免于钝化。
