非离子型表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚(ＡＥ),因其高效的去污能力,现已广泛用于各种重垢型洗涤剂,在市场上占主导地位,是生活污水和各种工业废水中的主要污染物.据报道,表面活性剂ＡＥ对水生植物稀脉浮萍有较大的损伤作用.但ＡＥ对其它水生植物的损伤作用,对环境的影响未见报道.本文以超氧化物歧化酶(ＳＯＤ)、过氧化氢酶(ＣＡＴ)和过氧化物酶(ＰＯＤ)的相对活力变化作为观测指标,进行了ＡＥ对大薸损伤程度的酶学诊断,为正确评价非离子型表面活性剂对水生植物的影响提供科学依据,同时也将丰富生物监测方法学内容.
1材料和方法
1.1 实验材料
大薸(水浮莲)(Pistia stratiotes L.)采自用作饲料的养殖场,洗净后于营养丰富、无污染的水池中增殖培养,很快繁殖出许多新个体.取生长状况良好、无坏死叶、大小一致的幼嫩植株,置已曝气过的自来水中预培养2ｄ,进行实验.非离子型表面活性剂:脂肪醇聚氧乙烯醚(ＡＥ),化学纯.
1.2 实验方法
1.2.1 处理培养条件 采用15Ｌ玻璃缸,加Ｓａｃｈｓ完全培养液6500ｍＬ,自然光照,θ(17±1)℃的温度下进行室内培养试验.ＡＥ试验浓度ρ(ＡＥ) ｍｇＬ-1设计为0、0.1、1.0、10.0、20.0、50.0,并进行一组平行试验.
1.2.2 样品的制备 每缸取2株,剪下所有的叶片,用打孔器打出小圆片,混匀,随机称取0.5ｇ.加少量ＣａＣＯ3粉末,0.5ｍＬ蒸馏水,充分研磨后用蒸馏水定容至50ｍＬ.充分摇匀,取悬浮液5ｍＬ进行ＣＡＴ测定;取25ｍＬ悬浮液,加100ｇ/Ｌ的Ｃａ(ＮＯ3)2定容至50ｍＬ,混匀,净置40ｍｉｎ后过滤,滤液作ＰＯＤ测定用;剩余的样品悬浮液经两层滤纸过滤,滤液用于测定ＳＯＤ活力[λ(ＳＯＤ)].
1.2.3 ＳＯＤ活力测定 采用ＳＯＤ测试盒(购自南京建成生物工程研究所).测试步骤按测试盒说明进行.ＳＯＤ活力[λ(ＰＯＤ)]单位定义为:1ｍｇ组织蛋白在1ｍＬ反应液中,抑制率达50%时所对应的ＳＯＤ量为一个活力单位(μ).将各浓度下测得的λ(ＳＯＤ)除以Ｃ
Ｋ组λ(ＳＯＤ),即得该浓度下ＳＯＤ相对活力(Λ(ＳＯＤ)).
1.2.4 蛋白质含量测定 采用考马斯亮兰Ｇ250法.
1.2.5 ＣＡＴ活力测定 采用硫代硫酸钠滴定法.ＣＡＴ活力[λ(ＣＡＴ)]单位定义为:在20℃条件下,1ｍｉｎ内1ｇ材料分解过氧化氢的量(μｍｏｌ).将各浓度下测得的λ(ＣＡＴ)单位除以ＣＫ组λ(ＣＡＴ),即得该浓度下ＣＡＴ相对活力[Λ(ＣＡＴ)].
1.2.6 ＰＯＤ活力测定 用愈创木酚法.ＰＯＤ活力单位定义为:20℃下,1ｇ材料所含酶在1ｍｉｎ内氧化愈创木酚的微摩尔数.将各ρ(ＡＥ)下测得的λ(ＰＯＤ)除以ＣＫ组λ(ＰＯＤ),即得该浓度下ＰＯＤ相对活力[Λ(ＰＯＤ)].
2结果与分析
2.1 ＡＥ对大薸ＳＯＤ比活力的影响
在ＡＥ污染环境中,大薸叶组织λ(ＳＯＤ)不同程度地被抑制,其抑制率与ＡＥ的浓度和处理时间相关.经ＡＥ处理96ｈ时,抑制率最小(图1).ρ(ＡＥ)为0.1、1.0、10.0ｍｇ Ｌ时,Λ(ＳＯＤ)随浓度的加大而降低.同一ρ(ＡＥ)胁迫下,随处理时间的增长,Λ(ＳＯＤ)逐渐增加,处理96ｈ时,达到最高,随后又有所降低;ρ(ＡＥ)为20.0、50.0ｍｇ Ｌ时,大薸的Λ(ＳＯＤ)经历了抑制—促进—抑制的过程,从处理24ｈ时,Λ(ＳＯＤ)活性很低,随后逐渐升高;在96ｈ时达到最高点后又逐渐下降.
图1 大薸Λ(ＳＯＤ)随处理ｔ/ｈ的变化曲线
2.2 ＡＥ对大薸Λ(ＣＡＴ)的影响
在ρ(ＡＥ)为0.1、1.0、10.0ｍｇ Ｌ胁迫下,大薸的Λ(ＣＡＴ)起初被抑制,经历一个较短的时滞(24ｈ)后,被很快激活;48ｈ时达到最高点,然后Λ(ＣＡＴ)逐渐下降;96ｈ时,基本恢复到正常水平,随后有些波动(图2).说明处理24ｈ时细胞中产生了较多的Ｈ2Ｏ2,细胞内的保护酶ＣＡＴ被很快激活或者ＣＡＴ酶的量增加,迅速清除Ｈ2Ｏ2,使细胞免受损伤.随着ρ(ＡＥ)升高,Λ(ＣＡＴ)抑制程度加大,50.0ｍｇ Ｌ时,Λ(ＣＡＴ)持续下降,144ｈ时,仅为ＣＫ的0.687,说明大薸细胞已受到严重破坏,即将siwang.实际培养过程,证实了这一点.
图2 大薸Λ(ＣＡＴ)随ｔ/ｈ的变化曲线
2.3 ＡＥ对大薸Λ(ＰＯＤ)的影响
在ρ(ＡＥ)0.1ｍｇ Ｌ污染下,大薸的Λ(ＰＯＤ)与ＣＫ组(0ｍｇ/Ｌ)较接近.但超过此浓度时,Λ(ＰＯＤ)被不同程度地促进(表1).大薸Λ(ＰＯＤ)随着ρ(ＡＥ)的增加而
表1 不同浓度ＡＥ胁迫下,大薸Λ(ＰＯＤ)随处理时间的变化
升高,ρ(ＡＥ)为20.0ｍｇ Ｌ时,Λ(ＰＯＤ)出现波动.
2.4 同一ＡＥ浓度胁迫下,三种酶活力比较
在ρ(ＡＥ)为10.0ｍｇ Ｌ胁迫下(因ＡＥ尚无排放标准,参照我国阴离子型表面活性剂ＬＡＳ的工业废水排放的一级标准为10ｍｇ Ｌ,ＧＢ8978-88).大薸叶组织同一份样品同时测定的Λ(ＳＯＤ)、Λ(ＣＡＴ)和Λ(ＰＯＤ)结果比较见图3.图中显示:大薸在ρ(ＡＥ)为10.0ｍｇ Ｌ的污染环境中,叶组织Λ(ＳＯＤ)受到明显的抑制,因而它不可能成为污染状态下的主要保护酶;Λ(ＣＡＴ)则经短暂的抑制后,很快上升,48ｈ达到峰值,随后下降,并在正常值附近波动.所以ＣＡＴ在细胞受伤的最初48ｈ内,对清除Ｈ2Ｏ2,保护细胞起着较大的作用.但随后Λ(ＣＡＴ)降低,对细胞的保护能力降低;Λ(ＰＯＤ)则一直保持较高的相对活力,96ｈ后稍有下降.ρ(ＡＥ)为0.1、1.0、20.0、50.0ｍｇ Ｌ时,结果类似.可以推测:在ＡＥ胁迫下,大薸清除自由基及其产生的过氧化物伤害,维持正常生理功能的主要酶应为ＰＯＤ.
3讨论
3.1 各种高等植物体内都存在3种主要的保护酶:
ＳＯＤ、ＣＡＴ和ＰＯＤ.正常状态下,植物体内由于各种生理生化反应,会不断地产生一些自由基(如Ｏ·-2、·ＯＨ、ＨＯ·-2),但这些自由基不会对植物产生大的伤害,因为它们很快被植物本身的保护酶系统清除,使自由基维持在较低水平.当植物处于污染环境中,由于自由基浓度大幅度增加,植物体内的这种平衡被打破,如果不能及时清除掉自由基,会导致膜脂过氧化,膜的选择透性功能丧失,细胞受损,甚至机体siwang.
本试验显示,当大薸处于非污染状态时(ρ(ＡＥ)=0ｍｇ/Ｌ),其叶组织中ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＰＯＤ酶都维持一定的活性(图1、2,表1).在非离子型表面活性剂ＡＥ污染环境中,大薸Λ(ＳＯＤ)被抑制,其抑制的程度随ρ(ＡＥ)升高而加大,Λ(ＣＡＴ)酶活性经短暂的抑制后很快升高,分解Ｈ2Ｏ2,48ｈ达到峰值后下降,以后维持在较低水平.大薸的Λ(ＰＯＤ)一直保持较高的活性,清除ＡＥ引起的细胞内过氧化物的增加,且Λ(ＰＯＤ)随ρ(ＡＥ)升高而升高,与植物的伤害程度正相关.所以,可以推测:大薸在ＡＥ污染下,ＰＯＤ是细胞中清除自由基、维持正常生理功能的主导酶.
3.2 在环境污染的生物监测中,常将生物的siwang率作为观测指标.但在现实生活中,除急性污染事故外,污染物一般处于较低的浓度.因此寻找更灵敏的检测方法成为当务之急.本试验表明:植物保护酶活性的变化是一种比较好的指标.大薸在ρ(ＡＥ)为10.0、1.0ｍｇ Ｌ时,未出现可见伤害症状,而ＰＯＤ、ＣＡＴ酶已在48ｈ内明显升高,ＳＯＤ则受到明显的抑制.因此,保护酶活性的变化远较可见伤害症状出现得早且更灵敏.在ρ(ＡＥ)为20.0、50.0ｍｇ Ｌ时,Λ(ＳＯＤ)、Λ(ＣＡＴ)极低,不能恢复到正常水平.可以推测:可能是由于自由基进一步增多,保护酶未能及时使之清除而导致细胞受伤,膜脂过氧化程度加剧,甚至解体,酶蛋白部分失去活性所致.这一点在大薸亚显微结构观察中得到了证实(另文发表).但Λ(ＰＯＤ)却一直较高而没受抑制,也许ＰＯＤ酶蛋白本身对ＡＥ不敏感.
3.3 从大薸Λ(ＳＯＤ)Λ(ＣＡＴ)和Λ(ＰＯＤ)变化情况诊断:在17℃下,ρ(ＡＥ)为0.1ｍｇ Ｌ时,对大薸的伤害程度极微;ρ(ＡＥ)为1.0、10.0ｍｇ Ｌ时,大薸受到较大的伤害,但保护酶能清除自由基,逐渐恢复正常生理活动;20.0、50.0ｍｇ Ｌ时,由于产生的自由基数量超出了保护酶的清除能力,细胞受到破坏,组织乃至整个植物体逐渐坏死.
3.4 采用相对活力作为观测指标,同一份样品同时测定三种酶的活力,能排除其它因素(培养过程中温度、光照、培养液营养物的浓度变化等)的干扰,且便于不同酶活力之间的比较.
参考文献
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