1 前言
电色谱概念由Pretorious于20世纪70年代提出,电色谱技术兼具了高效液相色谱的高选择性和毛细管电泳的高效性。近几年,电色谱技术在国内外研究者中已受到越来越多的重视,它不仅能应用于离子型化合物的分离,也能用于中性化合物的分离分析,但其本身存在的一些问题在一定程度上也阻碍着电色谱的发展。为此,我们建立了柱内合成毛细管电色谱(CEC)柱的制柱方法。用该方法合成的色谱柱,其最大特点是连续床层本身并不带电荷,而是通过阴离子表面活性剂动态改性使其产生电渗流,因而其制柱方法比有关文献[8～10]所报道的更为简单。这一类型电色谱柱的制备成功,丰富了毛细管电色谱柱的种类,拓宽了电色谱的分离模式。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Beckman P/ACESystem 5510自动化毛细管电泳仪(Beckman公司,美国),带紫外二极管阵列检测器,仪器控制和数据采集由Beckman System Gold工作站完成。熔融石英毛细管27cm(有效长度20cm)×100μmi.d.×375μmo.d.(河北永年光导纤维厂)。
甲基丙烯酸丁酯(BMA)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)(Sigma公司);正丙醇､硫脲及偶氮二异丁腈(AIBN)(上海第四试剂厂);十二烷基硫酸钠(SDS)(华美生物工程公司)为电泳纯;磷酸氢二钠(上海新华化工厂)和磷酸二氢钠(沈阳试剂三厂)均为分析纯。所有溶液均用Milli-Q超纯水(Millipore公司)配制,用0.45μm滤膜过滤。电渗流大小用硫脲标记。
2.2 电色谱条件
流动相为5mmol/L的磷酸盐缓冲溶液。实验采用电动进样,进样时间为1s～3s,进样电压为1kV～5kV,温度20℃,检测波长214nm,操作电压5kV～20kV,数据采集频率为16Hz。
2.3 原位柱的制备
首先用1mol/L的NaOH溶液冲洗毛细管空柱1h,再用去离子水冲洗柱管直到冲洗液pH为7.0,随后用甲醇冲洗柱管10min,用氮气吹干待用。
将BMA,EDMA及正丙醇按体积分数分别为10%,20%和70%均匀混合,所加引发剂AIBN的用量为聚合物单体用量的1%。混合液用超声振荡15min后,将反应液注入到预处理过的毛细管空柱中,控制一定的液柱长度,将毛细管的两端封口,浸入80℃水浴中反应24h。反应完成后,分别用甲醇和流动相冲洗该柱以去除管内残留试剂,最后将该柱在低压下平衡12h,即可进行正常实验。
3 结果与讨论
3.1 柱性能
考察了所制备的原位柱在阴离子表面活性剂SDS动态改性下的柱性能。实验发现,此型电色谱柱性能稳定,对于总长为27cm､有效长度为6.5cm的连续床柱,在其两端加电压为1kV～15kV时,电流(Y,μA)与电压(X,kV)之间保持良好的线性关系,相关系数为0.9997。结果表明,在此电色谱条件下柱内的焦耳热可忽略不计。中性化合物样品在此柱上连续10次进样运行,其死时间t0及保留时间的相对标准偏差分别为0.22%和<0.56%,说明中性化合物样品在此柱上的分离重复性良好。当以硫脲为电渗流标记物时,柱效可高达20多万理论塔板/m;芳香类中性化合物样品在SDS动态改性柱上分离时,其柱效也可达14万理论塔板/m。
图1所示为理论塔板高度(H)与柱内电渗流流速(u)的关系曲线。
图1 塔板高度与电渗流流速的关系
由图1可见,此柱在流速大于1.5cm/min时,柱效受流速的影响并不明显,这与连续床的大孔结构有关。由于聚合物在柱内形成大孔结构,使溶质在固定相内的扩散阻力变小,在流速增大时,其传质阻力项的影响就显得不明显,因此能在较大的流速范围内保持高柱效,使得该柱可用于样品的快速分析测定。另外,此柱在长时间的连续使用情况下,连续床层无移动现象出现,柱内出气泡现象也极少出现,避免了填充毛细管电色谱柱两端烧塞子而引起的易产生气泡及色谱柱的稳定性不够的缺陷。
3.2 表面活性剂的作用
由于此型柱是由BMA与EDMA共聚而成,并没加入带电荷的单体成分,因此这类柱的表面不带电荷,电渗流的产生相当困难。而电色谱本身要求有电渗流存在,为此我们在流动相中加入了阴离子表面活性剂,使其疏水端吸附于连续床层的表面,而使床层表面带上负电荷,从而产生从阳极至阴极的电渗流。所以说,在流动相中阴离子表面活性剂浓度的大小会对床层表面所带的电荷密度产生影响,即会对电渗淌度产生影响。电渗淌度与SDS浓度的关系如图2所示,当SDS的浓度增大时,电渗淌度的总趋势是随之增大,但当SDS的浓度增至一定值以后,电渗淌度的增大趋势有所减缓。这是由于开始时连续床层表面并没有SDS存在,所以SDS在床层表面的吸附量与SDS在流动相中的浓度成正比关系;但当床层表面吸附上一定量的SDS后,由于静电作用或者床层表面吸附作用点的减少而使吸附作用趋于饱和。
图2 电渗淌度与SDS浓度的关系
3.3 有机改性剂的影响
在CEC中,若流动相中加入有机改性剂常常会对电渗流产生影响,从而影响溶质的迁移速度及分离性能,特别是对于采用表面活性剂动态改性的情况,有机改性剂的作用更加重要。因此,我们考察了不同乙腈浓度对分离的影响,结果如图3所示。
图3 乙腈浓度对电渗流的影响
在一般的反相电色谱中,当乙腈浓度增大时,流动相的粘度会下降,导致电渗流的上升,其规律是电渗流随着乙腈浓度的上升而上升。而如图3所示的变化规律是电渗流随乙腈浓度的增大反而呈下降趋势,这是由于当乙腈浓度增大时,依靠疏水作用而动态吸附于柱内聚合物床层上的表面活性剂SDS的量将下降,由此引起连续床表面电荷密度的下降,从而导致柱内电渗流的下降。
3.4 分离应用
我们对吡啶及芳香类化合物进行了分离分析,其结果表明,所有化合物都达到了基线分离(见图4)。连续多次运行结果显示,此系统有很好的稳定性和可重复性,t0的相对标准偏差只有0.22%,柱效可达20余万理论塔板/m。
图4 电色谱图
4 结语
通过原位合成的方法可在毛细管内形成连续棒状色谱柱,对于非电荷型的原位柱可通过阴离子表面活性剂动态改性使其产生电渗流,从而可方便地应用于电色谱的分离实验。该类型电色谱柱避免了一般填充电色谱柱需在柱两端烧塞子的缺陷,且柱性能稳定,通过在流动相中改变阴离子表面活性剂的浓度可使电渗流按需要增大或减小。有关柱性能的评价和应用我们将作更进一步的研究。
