在生产实践和科学研究中,常出现表面活性剂和蛋白质相互作用的问题。明胶(1种典型的蛋白质)是摄影胶片的主要成分,而表面活性剂也是不可缺少的助剂;在各类SOD护肤霜、牛血清蛋白和木瓜蛋白酶营养霜等化妆品中,表面活性剂(作为乳化剂和稳定剂)和蛋白质也是必不可少的成分;在食品、膜蛋白的分离、酶蛋白的活力及构象研究等方面,都涉及表面活性剂与蛋白质相互作用的问题。因此,该项研究具有理论和实际价值。
表面活性剂与蛋白质相互作用研究的1个重要方面,是测定蛋白质与表面活性剂的结合量。SDS(十二烷基硫酸钠)与蛋白质的结合量呈典型的两平台形,在SDS浓度低时,1g蛋白质结合0.4gSDS。此时,它可以引起蛋白质的活力变化,但不引起构象变化;在SDS浓度较高时,1g蛋白质结合1.4gSDS。此时,蛋白质的构象变化明显。凝胶电泳法测定蛋白质分子量,也是以蛋白质对SDS的饱和吸附为前提。简单而准确的测定蛋白质与表面活性剂的结合量,对该项研究十分重要。
通常,测定蛋白质吸附表面活性剂的方法是“渗透平衡法”。但该法不仅复杂、耗时,而且不精确。我们发现,SDS与蛋白质相互作用有两种结果:1是在表面活性剂的浓度极低时(小于0.1mM),蛋白质不发生沉淀现象;在极低浓度到接近cmc(临界胶团浓度)之间,蛋白质有沉淀产生;在接近cmc以及大于cmc时,蛋白质沉淀现象消失。在沉淀发生区域,表面活性剂的量(浓度)发生微小变化,溶液的表面张力(γ)将发生明显的变化。
为此,本文提出了采用阴、阳离子表顶活性剂互滴定和表面张力两种简单方法测定蛋白质和表面活性剂的结合量,结果颇为近似,说明此2法在测定蛋白质对表面活性剂吸附方面是可行的。
1材料和方法
1.1 试剂
肌酸激酶(记为C.K.)是由兔骨骼肌肉纯化。醋酸、醋酸钠和分别在乙醇和丙酮中重结晶4次的十二烷基硫酸钠(SDS)和十六烷基三甲铵(C16H33N(CH3)3Br;HTAB)均为重庆化学试剂厂化学纯样品,三氯甲烷为上海后天山化学品厂分析纯样品,亚甲基兰为上海化学试剂3厂化学纯试剂,水为去离子水。
1.2 表面活性剂滴定法
用0.2MpH4.2的HAc-NaAc缓冲体系控制溶液的pH值(也可控制在其它pH值)。C.K.的浓度用紫外法控制在0.4～0.5mg/ml〔7〕。然后在各试管中加入SDS,最终浓度分别为0.4～0.9mM(附表)。反应30min后,于1×104r/min下离心5min,去沉淀,取一定上清液,在280nm下测其C.K.的浓度,然后以亚甲基兰为指示剂,利用1mM的HTAB滴定溶液中的SDS余量〔9〕,按下式计算吸附量:
式中,C1为原初SDS浓度(mm),C2上清液SDS浓度(mm),MSDSSDS分子量,C′1原初蛋白质浓度(mg/ml),C′2上清液蛋白质浓度(mg/ml)。
试验在室温(20℃±1℃)下进行。每点测定3个值平均,相对误差5%。
1.3 表面张力法
在pH=4.2(0.2MHAc-NaAc)下,采用滴体积法〔8〕测出纯SDS溶液的表面张力曲线(附图曲线1),浓度区间为10～0mmol/L,作出lgC-γ曲线。再测出有C.K.时(C.K.=0.494mg/ml,也可在0.4～0.5mg/ml浓度下)SDS溶液的表面张力变化,作出1gC-γ曲线(附图曲线2)。在蛋白质出现沉淀的区域,于1×104r/min下离心5min,测其上清液的表面张力。
在沉淀区域,于同一表面张力下,在曲线“1”和“2”上取点A和B,分别对应于浓度轴上两点C1,C2(分别为SDS的浓度),按下式计算吸附量:
式中,MSDS为SDS的分子量,CP蛋白质浓度(mg/ml)。
试验在室温(20℃±1℃)下进行。每点测定3个值平均,相对误差5%。
2结果与讨论
附表表明,与“渗透平衡法”的结果不同(结合量不随SDS浓度的增加而增加),滴定法和表面张力法,蛋白质与SDS的结合量都随SDS浓度的增加而增加。因此,本文测定的结果比文献结果更加可靠。
蛋白质与表面活性剂结合后沉淀的原因,还不十分清楚。本试验发现,SDS(带负电荷的表面活性剂)仅在溶液的pH小于蛋白质的等电点时,才可能引起蛋白质沉淀;在溶液的pH大于蛋白质的等电点时,不能沉淀蛋白质。溴化十二烷基三甲铵(带正电荷的表面活性剂)仅在溶液的pH大于蛋白质的等电点时,引起蛋白质的沉淀;在溶液的pH小于蛋白质的等电点时,不能沉淀蛋白质。因此我们认为,表面活性剂引起蛋白质沉淀,是由于蛋白质分子吸附了一定的SDS后,中和了蛋白质所带的相反符号的电荷,并同时引入了疏水链(表面活性剂的烷基链),大大降低了水化能。其次,不同蛋白质分子上的SDS疏水部分相互作用,从而“拉拢”了大量蛋白质相互聚集而产生沉淀。当离心去除蛋白质沉淀的同时,吸附在其上的SDS同时去除,二者有量的关系。由于蛋白质与表面活性剂充分接触,吸附的SDS和溶液中的SDS完全平衡(同一溶液中),这和“渗透平衡法”中,SDS蛋白质复合体在透析袋中与SDS单体(在透析袋外)在两个溶液体系中不同。因此,本方法的结果更接近于实际情况。
利用HTAB对上清液中的SDS进行反滴定,便易得到吸附的SDS量。而沉淀出的蛋白质量,通过沉淀前后对溶液中蛋白质的紫外吸收测定也易获得。“渗透平衡法”需要2～10天的平衡,且对SDS的定量测定程序复杂。而滴定法的测定程序较简便,只需2h即可完成试验。与文献结果比较,滴定法的结果基本在1个范围内,而且随SDS浓度变化而变化,这更符合实际情况,说明有较高的准确性。
溶液的浓度在其cmc以前,表面活性剂的浓度有微小的变化,溶液的表面张力将明显变化,表面张力法就是利用这一特点。通过对溶液表面张力的测定可得知溶液中SDS的浓度变化。当溶液中蛋白质沉淀比较完全(达80%～90%左右)时,可以认为溶液中所剩蛋白质对体系表面张力的影响已相当小(实际上,蛋白质本身对溶液的表面张力几乎没有影响),可忽略不计,溶液的表面张力便可认为只受SDS的影响。在相同表面张力下,对照纯SDS的标准曲线,便可知此时溶液中SDS的浓度。该方法也比较简单,标准曲线做好后,4～5h即可完成试验。与文献结果比较,表面张力法的结果也基本在同1个浓度范围中,而且结果也随溶液中SDS浓度的变化而变化,说明该方法的结果更符合实际,表明表面张力法有较大的准确性,其操作过程较滴定法更简便(不需要滴定终点指示剂),可以利用表面张力仪或简便的方法测定表面张力。此方法的另一优点是所需药品量极少,只需0.5ml试液(约0.1～0.2mg样品),是滴定法无法比拟的,这对于贵重的蛋白质样品无疑是很经济的。
本方法的实用范围较小,仅能在沉淀区或表面张力巨变区实用。
附表 肌酸激酶对SDS的吸附量
注:文献中的SDS值均为0.400。
参考文献
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