脂质体是由磷脂和胆固醇等物质在水溶液中形成的球状小囊 , 能包封各种物质并将它们选择性的运送到肝､脾等网状内皮系统丰富的器官 , 是一种靶向给药的新型药物载体｡但脂质体到达网状内皮系统以外器官的几率比较低 , 这主要是由于脂质体大部分都被巨噬细胞吞噬后截留于肝脏和脾脏中了 , 因此在其他器官中分布的比较少 , 特别是脑组织 , 脂质体对所包封药物跨血脑屏障 (blood brain barrier , BBB ) 的转运几乎没有促进作用 , 因此需要对脂质体进行修饰 , 以增加脂质体在体内的稳定性 , 以利于对脂质体进一步修饰 , 增加对其他器官的靶向性｡
脂质体的常用修饰剂为聚乙二醇的衍生物 , 如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 聚乙二醇 (DSPE-PEG) 等 , 通过在脂质体的表达形成水化膜来提高脂质体的体内稳定性｡但价格昂贵 , 限制了它的应用范围｡吐温 80( T ween 80) 和苄泽 35( B rij 35) 均是药用的表面活性剂 , 含亲水性和疏水性的长链 , 连接到脂质体的表面后可能会增加脂质体的稳定性 , 且文献报道用T ween80 包衣后的纳米粒更易进入脑组织｡为此本文比较T ween 80 ､B rij 35 和 DSPE-PEG 对伊文思蓝脂质体 ( EB - L ) 的包封率和体内组织分布的影响 , 以寻找 DSPE-PEG 的替代品 , 扩大脂质体的应用范围｡伊文思蓝 ( E vens blue, EB ) 是一种生物染料 , 具有极强的水溶性 , 进入血液后能与血浆白蛋白结合 , 形成大分子的复合物 , 被广泛用作血浆体积测定及BBB和毛细血管通透性的研究｡本文采用EB作为一种模型药物 , 通过测定EB脂质体在小鼠体内的组织分布 , 特别是在脑组织中的浓度变化 , 来考察脂质体跨过BBB的能力 , 为脑靶向给药系统的研究开发提供基础｡
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
1.1.1试剂 : EB : 德国S erva 公司进口分装 ; DSPE-PEG Me : 美国S hearwater 公司 ; 豆磷脂 (soybean phosphatidylcholine, SPC ): 德国L ucas M eyer GmbH公司进口分装 ; 胆固醇 (cholesterol, C hol): 北京化学试剂公司 ; 氯仿和甲醇等均为市售分析纯 ; T ween 80: 香港FARCO化学试剂供应公司 ; B rij 35: S igma 公司｡
1.1.2 仪器 : UV— 120 — 02 紫外—可见分光光度计 ( S himadzu); ZFA— 85 A旋转蒸发器 ( 上海医械专机厂 ); CTX— 50 型浴式超声仪 ( 北京医疗设备二厂 ); 涡悬振荡器 ( 上海医科大学仪器厂 ); 磁力搅伴器 ( 北京北得科学器材分司 ) ｡
1.1.3 动物 : SD大鼠由北京大学医学部实验动物科学部提供 , 体重 (250 ± 20) g｡
1.2 方法
1.2.1 脂质体的制备 : 将SPC∶Chol (3 ∶ 1, m olar ratio) 用氯仿异丙醚混合溶剂溶解后加入EB的水溶液 , 采用改进的反相蒸发性制备EB L ｡
1 2 2 脂质体包封率的测定 : 用葡聚糖凝胶G-50( S ephadex G -50) 柱分离EB脂质体和未被包封的EB , 洗脱液为蒸馏水 , 收集脂质体部分的洗脱液并用T riton X -100 破坏脂质体 , 然后用紫外可见分光光度计于 621 nm处测定EB - L的总浓度及脂质体部分EB的浓度 , 计算EB - L的包封率｡
1.2.3 Chol与SPC的比例对EB L包封率的影响 : 调节处方中Chol与SPC的总量 , 按照 1. 2. 1 项与 1.2.2 项下的方法制备EB - L并测定其包封率的变化｡
1.2.4 DSPE-PEG ､T ween 80 和B rij 35 对EB脂质体包封率的影响 : 将一定量的 DSPE-PEG ､C hol 等一起用氯仿溶解后成膜 , 按 1.2.1 和 1.2.2 项下的方法制备用 DSPE-PEG 修饰的脂质体EB - L - PEG , 测定包封率｡分别用T ween 80 和B rij 35 替换 DSPE-PEG E , 重复上述的实验 , 得到分别用此二者修饰的脂质体EB - L - T ween 80 和EB - L - B ri j 35 ｡
1.2.5 组织中EB浓度测定方法的考察 : 改进李少华等测定组织中EB的方法 , 采用甲酰胺提取 紫外分光光度法测定小鼠各脏器中EB的浓度｡每 100 mg组织加入 1 ml甲酰胺 , 然后于 37 ℃温浴下振荡提取 72 h , 在 623 nm处测定甲酰胺提取液的吸光度 , 计算标准曲线 , 方法的精密度和提取回收率｡
1.2.6 不同表面活性剂对EB脂质体在大鼠体内分布的影响 : 取大鼠 60 只 , 分为 4 组 , 麻醉后固定在鼠板上 , 解剖分离股静脉和两条颈动脉 , 分别经股静脉恒速输注EB - L､EB - L - PEG､EB - L - Tween 80 与EB - L - Brij 35, 流速为 1 ml / min , 剂量为 10 mgEB /100 g体重｡为除去脑毛细血管内残留血中所含EB对灌流 5 min后剪断颈静脉和颈动脉 , 继续灌流 40 min , 然后解剖分离脑､肝､脾和肾最后脑组织中EB浓度测定的干扰 , 需要给药结束后 0.25 ､ 0.50 和 1.0 h时经颈动脉灌流生理盐水 , 流速 1.0 ml / min , 用 1.2.4 项下的方法测定各脏器中EB的浓度｡
2 结果
2.1 胆固醇与SPC的比例对EB脂质体包封率的影响 : 见表 1 ｡Chol是脂质体膜的稳定剂 , 当它与SPC的比例变化时 , 会对脂质体的包封率和稳定性有较大的影响 , 尤其是水溶性EB｡当SPC与Chol的质量比为 20 ∶ 15 时 , 所得脂质体对EB的包封率提高｡选择包封率最高的EB脂质体用于检测其在大鼠体内的组织分布状况｡
2.2 不同表面活性剂对EB脂质体包封率的影响 : 见表 2 ｡ DSPE-PEG, B rij35 和T ween80 均具有疏水性长链 , 能插入脂质体膜 , 而亲水端伸展于脂质体的表面 , 由于这 3 种物质本身的成膜性差 , 在脂质体膜中所占的比例过大时 , 会破坏脂质体膜的稳定性 , 降低脂质体对水溶性物质的包封率｡
2.3 组织中EB含量测定方法的建立 : 小鼠组织中 EB 的质量浓度在 0.5 ~ 10 mg / ml的范围时 , 提取液的吸光度与浓度呈良好的线性关系｡方法学考察结果见表 3 ｡标准曲线和相关系数的计算结果见表 4 ｡该结果说明 : 用甲酰胺提取紫外分光光度法测定脏器中 EB 的浓度 , 结果准确 , 重现性好 , 能有效地减少脏器中残留血迹中非测定性成分产生的荧光对结果的干扰｡
2.4 不同表面活性剂对ＥＢ脂质体在大鼠体内组织分布 : 图1 ～ 5 。
未修饰的EB脂质体组的药物主要分布在肝､脾和肾中 , 脑中EB的浓度比较低｡用 DSPE-PEG, B rij 35 修饰后的脂质体组在肝､脾和肾中的EB浓度均有不同程度的降低 , 用T ween 80 修饰后的脂质体组在脑组织中的EB浓度有所上升 , 而肝和脾中的浓度却没有显著性变化｡这说明脂质体脑中的浓度明显高于其他各组｡
3 讨论
3.1 脂质体膜修饰剂对EB - L包封率的影响 : 胆固醇是脂质体膜的一种收紧剂 , 当磷脂与胆固醇的比例合适时 , 脂质体膜会比较致密 , 内水相中的药物才能不渗漏出来 , 也只有被包封到脂质体内部后才会改变它在体内的组织分布 , 提高在靶器官中的浓度｡所以针对不同的药物和磷脂 , 需要调节处方中Chol的比例以得到较高包封率和稳定性的脂质体｡ DSPE-PEG ､T ween 80 和B rij 35 均具有较长的疏水性长链 , 能插入脂质体膜中 , 亲水性部分伸展于脂质体的表面形成水化膜来增加脂质体的稳定性｡但由于这三者的成膜性较差 , 使脂质体膜变得疏松 , 会破坏脂质体的稳定性 , 因此用这三种物质修饰后的脂质体对水溶性物质的包封率均有不同程度的下降｡
3.2 脂质体膜修饰剂对EB - L组织分布的影响 : B rij 35 为单链结构 , 两端分别为疏水的烃基和亲水的聚乙二醇 , DSPE-PEG 含两条疏水链和一条亲水链 , 两者均能使所修饰的脂质体避免被网状内皮系统吞噬 , 降低肝和脾中的EB的浓度 , 说明这两者能增加脂质体的体内稳定性｡T ween 80 具有一条较长的疏水链和三条比较短的亲水链 , 长度约为B rij 35 和 DSPE-PEG 亲水链的 1/3, 修饰后的脂质体静脉给药后在肝和脾中EB的浓度与未修饰组接近 , 但明显高于用 DSPE-PEG 和B rij 35 修饰的脂质体组 , 说明T ween 80 保护脂质体体内稳定性的能力比这两者差 , 且在增加脂质体逃避网状内皮系统的吞噬方面能力有限 , 可能是由于亲水端体积大于疏水端的体积 , 使脂质体膜变得不稳定 , 较短的亲水端所形成的水化膜也不能使脂质体完全不被网状内皮系统识别｡
脑中EB浓度测定结果表明 : 在脂质体的表面用亲水性长链修饰后能不同程度地提高药物在脑组织中的分布 , 其中较突出的是T ween 80 修饰的脂质体组 , 说明T ween 80 能增加脂质体进入脑组织的能力 , 这与K reuter 报道的T ween 80 能抑制P 糖蛋白 ( P -glycoprotein, P - gp ) 的外排功能､用它包衣后的纳米粒跨BBB能力明显增加相一致 , 但由于Tween 80 修饰后的脂质体易被网状内皮系统吞噬而使肝和脾等器官中EB浓度增加 , 所以如果能同时采用能增加脂质体膜稳定性和延长体内循环时间的成分修饰EB - L - T ween 80, 则会增加脂质体到达脑组织的几率 , 脑中EB的浓度还会有所提高 , 这对于研究脑靶向脂质体具有重要的参考价值｡
