在临床上常发现骨移植后延迟愈合､不愈合､骨折､感染及后期骨关节炎等问题。主要原因是移植骨作为异体(异种)组织,产生免疫反应,导致移植失败。因此研究降低排斥反应的方法仍是目前骨科基础研究中较为活跃的领域之一,本文希望比较和探索出一种降低骨组织免疫原性的新方法。
1 材料和方法
1.1 制备工艺 鼠骨均为0.286g,(1)冻干法(FD):置冻干机中冻干24h;(2)深冻法(DF):-80℃,存无菌玻璃瓶2周;(3)氯仿甲醇脱脂法(LECM):按Urist方法,氯仿/甲醇脱脂､冻干各24h;(4)表面活性剂脱脂法(LLA):LLA脱脂､冻干各24h。1.2 动物实验 CD1小鼠20只,雄性,体重20～24g,取四肢长骨,去除骨髓和软组织。共1.144g,做以上4种处理､灭菌后,分2组,一组做为体内抗原(0.572g),注入72只CD1小鼠腹腔内,另一组做为体外刺激性抗原(0.572g),同时设阳性对照(小鼠注入新鲜鼠骨混悬液)､空白对照(模拟实验,给小鼠注入PBS)。术后7､15､30d摘眼球取血,清洁取脾。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 淋巴细胞刺激增殖实验 取各组小鼠长骨0.286g,加生理盐水10ml,匀浆,4℃下静置24h,离心15000rpm×30min,取上清液做抗原。无菌取脾,研磨,洗涤,离心,1640调整浓度至6.0×106/ml,做体外受刺激细胞,96孔培养板加入脾细胞悬液和上述处理的骨上清液各100μl/孔,复设3孔,正常鼠脾细胞悬液相同细胞数作对照,5%CO237℃孵育72h,加入3H-TdR 0.5μCi/孔,孵育18h,用细胞收集器收集样品于玻璃纤维纸上,红外线烤干。加入闪烁液0.5ml,Beckman LS6500型β计数仪上进行β计数,计数淋巴细胞刺激指数(SI)。SI=特异性抗原刺激组计数/阴性对照组计数。结果判定:si>I,说明存在特异性淋巴细胞刺激增殖效应。
1.3.2 ELISA法血清抗体检测 小鼠摘眼球取全血,4℃放置10h,吸取血清抗原,将4种骨组织的上清液用Na2CO3/NaHCO 3包被稀释成2.5μg/ml,加入微量滴定板中,0.1ml/孔,置37℃1h,4℃18h,洗3次,将待测血清抗体用含0.1%BSA的洗液稀释成1∶20,加入滴定板中,0.1ml/孔,以阴性对照组小鼠的血清为阴性参考血清,同时设不加任何血清的空白对照,加入1∶2000HRP酶标抗体,0.1ml/孔,37℃1h,洗3次,加入1∶4000新配TMB底物显色,0.1ml/孔,37℃20min,逐孔加入2mlH2SO4终止反应,0.05ml/孔。测定各孔的吸光度值,结果判定:以大于或等于阴性参考血清OD值2.1倍的待检血清为阳性,否则为阴性。
1.3.3 IL-2生物活性测定 无菌取脾(方法同上),1700rpm×7min离心,收集细胞,1640培养液调细胞浓度至5×106/ml,加入新鲜无菌骨上清液4ml,装入培养瓶置37℃,5%CO2孵箱中孵育48h,离心2000rpm×15min,收获上清,上清中含IL-2。IL-2生物活性测定:将处于对数生长期的FI-2细胞用10%FCSRPMI 1640洗涤､离心,调整细胞数1.0×105/ml,96孔培养板100μl/孔,再分别加入待测脾细胞上清100μl,重复3孔,不同浓度标准rHIL-2和完全培养基作对照,5%CO2孵箱37℃培养21h,掺入3H-TdR 0.5μCi/孔,孵育6h,用细胞收集器收集样品于玻璃纤维纸上,红外线烤干。加入闪烁液0.3ml,于Beckman LS 6500型β计数仪上进行β计数。结果计算:SI=特异性抗原刺激组IL-2单位/ml/阴性对照组IL-2单位/ml。
1.3.4 迟发性过敏反应 4种处理加阳性对照的鼠骨混悬液,浓度5×107/ml,腹股沟皮下注射,0.2ml/支;7d后脚掌再次注射同抗原,浓度2×108/ml,50μl/支,另一脚掌注射生理盐水50μl/支做对照,24h后用显数的游标卡尺量其厚度。
1.3.5 体外细胞毒性实验 将上述4种处理的鼠骨环氧乙烷消毒,加入MEM原液2.5ml,37℃水浴24h,过滤,吸取上清液2.4ml,加入MEM原液2.4ml,灭活的小牛血清0.48ml,配成样品应用液,做为抗原。细胞株为L-929细胞。细胞悬液制备:用细胞培养基配制4×104个/ml细胞悬液分注于试管内(1ml/管),37℃24h;材料浸提液制备:将细胞培养基按1cm2试样表面积10ml的比例加入放有试样的试管中,37℃下浸提24h;每管舍弃原培养液,阴性对照组用新鲜培养液交换,材料组用含50%浸提液的新鲜培养液交换,并用3只阴性对照管细胞计数,其余置37℃培养;于2､4､7d将对照组和材料组各管细胞计数,计算相对增殖度(RGR):RGR=(材料组平均值/阴性对照组平均值)×100。
1.4 统计学方法 采用SPSS10.0软件,各组间数据行单因素方差分析,全组数据行配伍组方差分析,各项指标均以平均值±标准差(x±SD)表示。
2 结 果
2.1 溶剂浑浊度和处理后材料外观 LLA脱脂法:试管内可见明显浑浊及白色沉淀,骨中未见明显油脂;LECM脱脂法:试管内可见絮状浑浊及乳白色沉淀;DF法:骨由鲜红变为紫红,肉眼可见油脂;FD法:骨由鲜红变为淡紫红,肉眼可见油脂。
2.2 重量损失情况表
重量损失LLA>LECM>FD>DF,LLA可去除产生抗原性的主要物质(油脂和细胞)。
2.3 术后体外淋巴细胞刺激增殖实验
图1为将小鼠7､15､30d处死,对其脾淋巴细胞刺激后的结果。
术后15d:FB>FP>FD>LECM>LLA,30d:FB>LECM>FP>FD>LLA,(P均<0.05)
2.4白介素-2(IL-2)生物活性的测定图2为7､15､30dIL-2生物活性的相对值,结果如下:
术后7d排序为:FB>DF>FD>LECM>LLA(P<0.05),15d为:DF>FB>FD>LECM>LLA(P<0.05),30d为:FB>DF>FD>LECM>LLA(P<0.05)
2.5 术后血清特异性抗体检测(ELISA)
取小鼠血清,测定相对OD值,了解体液免疫的情况,结果如下:
术后7d顺序为:FB>LECM>DF>LLA>FD(P<0.05);术后15d为:FB>LECM>DF>FD>LLA(P<0.05);术后30d为:FB>DF>FD>LECM>LLA(P<0.05)。
2.6 迟发性过敏反应
7､15､30d测鼠脚掌厚度,了解迟发性过敏反应的情况:
术后7d的排序为: FB>LECM>DF>LLA>FD (P<0.05);术后15､30d的排序为:FB>DF>FD>LECM>LLA(P<0.05)。
2.7 体外细胞毒性试验结果
3 讨 论
3.1 目前国内外减低抗原性的方法如下 降低免疫活性:冷冻及冻干法,应用最广,Krenz､Elves等实验可证明,去除免疫物质:(1)脱钙法:脱钙骨不仅能降低骨的免疫原性,而且具有较强的骨诱导力;(2)抗原提取法:Urist设计:氯仿甲醇脱脂,盐酸脱钙,此骨既除去抗原性又保留诱导成骨的能力;(3)煮沸､辐照､甲醛:虽降低了骨抗原性,但严重破坏了骨生物学性能,目前已少用。
3.2 罗卓荆提出骨移植的抗原主要存在细胞表面, Urist脱脂用的氯仿/甲醇对人体有害,而LLA为两种表面活性剂的组合,其特点为:(1)具有较有机溶剂更好的脱脂效果,可有效的去除骨中的主要抗原物质及脂质,获得免疫原性既低,又具有一定机械能力的骨移植材料;(2)水溶性,可在体内生物降解,对人体安全;(3)此方法处理的骨组织保持了天然的网状空隙结构,新骨易长入,植入骨易被替代,不在体内长期残留,从理论上将有利于骨组织的愈合。
3.3 本研究从不同的免疫方面具体了解表面活性剂降低免疫反应的程度
3.3.1 体外淋巴细胞刺激增殖实验可见:(1)4种处理方法均可引起细胞免疫反应,LLA引起的排斥反应最小;(2)LLA,LECM的SI值始终接近于1,表现出抗原性较弱。
3.3.2 白介素 2生物活性的测定提示:(1)IL-2做为T细胞分泌的一种细胞因子,敏感的反应出早期细胞免疫的情况,即7d升高最明显,LLA的增殖指数相对较低;(2)LLA测得的增殖指数在4组中最低(SI=1.7),说明LLA脱脂后的骨抗原性较弱。
3.3.3 血清特异性抗体检测得出:(1)急性期4种处理方法均引起较强的体液免疫反应,随时间推移,抗体水平逐渐降低,而LLA诱发的体液免疫反应最小,与其他各组差异性显著(P<0.05)。
3.3.4 迟发性过敏反应表明随刺激及植骨次数的增加,DF､FD引起的迟发性过敏反应增强,LECM,LLA迟发性过敏反应始终较弱。
3.3.5 体外细胞毒性实验表明:LLA为一级,为骨移植材料合格产品,对细胞及机体无潜在毒性作用;LECM为二级,在合格产品边缘,对细胞及机体可能存在潜在毒性作用;FD､DF为三级,属不合格产品,对细胞及机体有潜在毒性作用[按照国家标准所做,标准号为GB/T16175 1996]。
综上所述,冻干､深冻法虽然将骨细胞杀死,但细胞残体仍滞留于骨内,因此会引起强烈的免疫反应,LECM引起的免疫排斥反应较弱,这一现象与Mascolo等的实验结果相符合,但氯仿/甲醇对人体有剧毒,即使经过多次漂洗仍有残留,因此对人体有害,本研究所采用的LLA引起的免疫反应比LECM又低一些;LAS/AES做为一种表面活性剂可有效去除骨中的主要抗原物质及脂质,成功获得了免疫源性既低,又具有一定机械能力的骨移植材料。
总之,用表面活性剂LLA脱脂,可有效降低骨组织的免疫原性,减少移植骨的免疫排斥反应。
