在科学研究中 , 经常遇到表面活性剂和蛋白质的相互作用问题 , 而表面活性剂对蛋白质的变性作用非常复杂 , 有人曾研究过表面活性剂与酶的相互作用 , 利用 SDS 在等电点以下沉淀蛋白质 , 而等电点以上的蛋白质不被沉淀的原理 , 分离了某些蛋白质的混合物 , 且一次分离达到电泳纯 。 也有人指出 , 表面活性剂和蛋白质的结合 , 使蛋白质的二级有序结构 ( α螺旋 , β折叠等 ) 增加或减少 , 或不影响蛋白质的二级结构 。 表面活性剂对蛋白质活力和构象的影响与表面活性剂的类型有关 。
本文试验了非离子表面活性剂 (Tween 80), 阳离子表面活性剂 (CTAB,CPB), 阴离子表面活性剂 (SDS,LAS) 对 BSA 的变性作用 。 在不同实验条件下 , 经紫外扫描以及测定 BSA 在 280nm 处的吸光度值的变化来解析 BSA 光谱性能的改变 。 结果发现 , 在临界胶束浓度附近 , 几种表面活性剂对 BSA 有稳定和保护作用 , 为在双水相､非有机溶剂液固萃取以及泡沫浮选中 , 用表面活性剂分离蛋白质 , 做了一些基础研究工作 。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
UV-240 型紫外 - 可见分光光度计 ( 日本岛津 );pHS-3 型酸度计 ( 上海第二分析仪器厂 );Tween80(上海三浦化工有限公司 ) 化学纯 ;CPB( 上海计划生育科学研究所 ) 化学纯 ;CTAB( 湖南湘中化学试剂开发中心 ) 分析纯 ;SDS( 武汉化学试剂厂 ( 进口分装 )) 分析纯 ;LAS( 上海化学试剂采购供应站 ) 化学纯 ;BSA( 武汉中健科技发展有限公司 ( 进口分装 ))。
1.2实验方法
1.2.1 确定表面活性剂浓度的方法
将 5 种表面活性剂分别配成不同浓度的系列溶液 。 在 1.0cm 比色皿中 , 加入 1.0mg/mL 的 BSA 溶液 1.5mL, 加入一定量的表面活性剂溶液 , 用二次水补至 3.0mL, 混匀 , 在 190~380nm 处扫描 。
1.2.2 缓冲溶液的配制
磷酸氢二钠与柠檬酸系列缓冲溶液 , 甘氨酸与盐酸缓冲液 , 甘氨酸与 NaOH 缓冲液均按文献配制 。
在 pH1.30~9.64 范围 , 试验了酸度对 3 种表面活性剂与 BSA 作用的影响 。BSA 与 5 种表面活性剂作用的浓度均为500μg/mL。若作用后 ,280nm 处无特征吸收峰 , 则称为 BSA 变性 。
2 结果与讨论
2.1 表面活性剂浓度的影响
表 1 5 种表面活性剂的临界胶束浓度和使 BSA 变性的浓度 
*: 当 CTAB 和 SDS 的浓度分别达 0.2 和 0.4mol/L 时 ,BSA 仍未变性 。
Tween 80,CTAB,CPB,SDS,LAS 的临界胶束浓度 (CMC) 和使 BSA 变性的浓度如表 1。
表 1 说明 Tween 80 的浓度在 1%~1.0×10-3% 之间变化 , 对 BSA 在 280nm 处的吸收峰没有影响 , 阴､阳离子表面活性剂的浓度由低到高变化时 ,280nm 处吸收峰逐渐增高 , 在临界胶束浓度附近达最高 , 大于临界胶束浓度后 , 峰高又有所降低 。 实验结果表明 ,5 种表面活性剂与 BSA 作用的最佳浓度分别为 :Tween80:0.05%( 体积百分比);CTAB:1×10-4mol/L;CPB:5×10-5mol/L;S
DS:5×10-3mol/L;LAS:1×10-3mol/L。 图 1 是 BSA 在 280nm 处的特征吸收 ; 图 2 明 ,Tween80,CTAB ､ SDS 在紫外无特征吸收峰 ; 图 3 显示 ,CPB 和 LAS 在紫外均有特征吸收峰 ; 图 4 为 Tween80 ､ CTAB ､ SDS 在最佳浓度时分别与 BSA 的混合物紫外吸收谱图 。
室温下 , 当 CTAB 的浓度 >0.2mol/L,SDS 的浓度 >0.4mol/L 时 ,BSA 在 280nm 处仍有明显的特征吸收峰 , 峰高比未加表面活性剂时略有降低 , 说明 CTAB 和 SDS 的加入 , 对 BSA 在紫外的吸收无显性影响 , 而 Tween80 浓度小于 1% 时 , 对 BSA 在 280nm 处的吸收峰没有影响 。 因此可采用这 3 种表面活性剂对蛋白质混合物进行浮选分离 。
2.2 作用时间的影响
试验了不同浓度的 Tween80,CTAB 和 SDS 与 BSA 的混合溶液 , 于 280nm 处的吸光度值随时间的变化 。室温 ,pH6.00~7.00 条件下 ,15h 内 ,Tween80 浓度小于 0.05%, 对 BSA 的吸光度值没有影响 。 而 CTAB 和 SDS 在临界胶束浓度附近 , 对 BSA 在 280nm 处的吸光度值也没有影响 ; 当 CTAB 浓度小于 1×10-6mol/L,SDS 浓度小于 2×10-4mol/L, 时间超过 30h,280nm 处的吸光度值逐渐降低 ; 而 CTAB 浓度大于 5×10-2mol/L,SDS 浓度大于 5×10-2mol/L,Tween80 浓度大于 0.1%, 时间超过 15h,280nm 处的吸光度值就显著降低 。15h 内 , 在临界胶束浓度附近 ,3 种表面活性剂使 BSA 在 280nm 处的吸光度值不变 , 说明在临界胶束浓度附近 , 这 3 种表面活性剂对 BSA 有保护作用 。
2.3 酸度的影响
实验结果显示 , 用 pH4.50~6.00 之间的磷酸缓冲液时 ,3 种表面活性剂与 BSA 的混合液在 280nm 处的吸光度值比 BSA 在 280nm 处的吸光度值略高 , 而用 pH2.50~4.00 的磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液或 pH7.00~9.00 的甘氨酸 -NaOH 缓冲液时,280nm 处的吸光度值偏低 , 与 BSA 在 280nm 处的吸光度值偏差为± 0.02。 在实验的 pH 范围内 , 酸度对表面活性剂与 BSA 之间的作用影响不大 , 也没有使 BSA 沉淀 。表明非离子型表面活性剂 Tween 80, 在实验的酸度条件下均不沉淀蛋白质 ; 浓度较高的离子型表面活性剂 CTAB 和 SDS, 在实验的酸度范围内也不会引起蛋白质沉淀 。此结果与文献的报道类似 。
综上所述 , 表面活性剂与蛋白质的作用各有不同 ,LAS 与 BSA 作用时 , 酸度影响很大 , 当 pH 小于 4.50,LAS 与 BSA 产生白色絮状沉淀 , 不适于泡沫浮选分离 。于室温 , 中性溶液中 ,Tween 80 浓度 <5%,CTAB 浓度 <0.2mol/L,SDS 浓度 <0.4mol/L,CPB 在临界胶束浓度附近 , 适于蛋白质混合物的泡沫浮选分离 。 另外 , 蛋白质和表面活性剂的种类 , 还需进一步探讨 , 以便为泡沫浮选分离蛋白质提供实验指导。
