测定抗坏血酸的亚甲蓝褪色光度法

坏血酸(又称维生素C),普遍存在于水果和蔬菜中,是一种重要的营养物质和药物,也是一种用途广泛的工业原料｡人体如果缺乏维生素C将导致多种疾病的发生,严重时将导致坏血病､心脏及肝脏损伤等疾病｡同时,维生素C在医院临床上用于辅助治疗坏血病､药物中毒､癌症等疾病,具有消除人体自由基､防止关节肿大､促进外伤愈合､增强机体抵抗能力等作用｡因此,食品､饮料､医药､医疗等行业都需要进行维生素C含量的测定｡
    目前测定维生素C含量有多种方法,主要包括用I₂或其他氧化剂进行氧化还原滴定､毛细管电色谱法以及采用化学发光光度法､动力学分光光度法､直接光度法等｡这些方法各有长处,但有些需使用昂贵的仪器,有些操作繁琐､选择性差｡本文采用的亚甲蓝褪色光度法能够方便地测定还原态的抗坏血酸,具有良好的选择性,同时还具有仪器设备简单､操作简便､准确可靠等特点;应用于饮料､药品等样品中抗坏血酸的现场测定,得到满意结果｡

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

722型光栅分光光度计(山东高密分析仪器厂);电热恒温水浴锅(江苏南通县通海电器厂)｡抗坏血酸(维生素C):沈阳试剂一厂产品,分析纯;亚甲蓝:天津石英钟厂霸州化工厂产品,分析纯;无水对氨基苯磺酸钠:同济微量元素研究所产品,分析纯;盐酸和氯化钾:天津市化学试剂一厂产品,均为分析纯试剂｡

抗坏血酸溶液:准确取0.1g抗坏血酸溶于少量蒸馏水中,放入100mL棕色容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,此溶液的抗坏血酸含量为1.0g/L,作为储备液,使用时现用现配,稀释成含量为100mg/L｡盐酸储备液:用移液管移取8.4mL盐酸,放入100mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,此溶液盐酸浓度为1.0mol/L｡氯化钾储备液:准确称取39.3333g氯化钾,溶于水中,放入100mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,此溶液氯化钾浓度为5.3mol/L｡缓冲溶液(pH=2):准确移取10mL盐酸储备液和20mL氯化钾储备液至100mL的容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,此缓冲溶液的酸度为pH=2.0｡亚甲蓝溶液:准确称取100mg亚甲蓝溶于少量水中,放入100mL的容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,此溶液的质量浓度为1g/L,使用时用水稀释成100mg/L｡对氨基苯磺酸溶液:准确称取100mg对氨基苯磺酸溶于少量蒸馏水中,放入100mL的容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,此溶液的质量浓度为1g/L｡

本实验所用的水均为二次蒸馏水｡

1.2实验方法

取两支25mL带塞比色管,分别加入100mg/L亚甲蓝溶液1mL､1g/L无水对氨基苯磺酸溶液2mL､pH=2的缓冲溶液5mL｡其中一支再加入1.0g/L的抗坏血酸标准溶液1mL,用蒸馏水稀释至刻度线,摇匀,放入25℃的水浴锅中保温20min,取出,在波长660nm处,以未加抗坏血酸工作液为参比,测定吸光度;并以吸光度的绝对值为纵坐标,以抗坏血酸的用量(体积数mL)为横坐标绘制标准曲线｡

2结果与讨论

2.1吸收光谱

亚甲蓝的最大吸收波长在加入抗坏血酸前后没有变化,仍然为660nm,如图1,因此,选择660nm为测定波长｡图1中曲线1是没有加抗坏血酸时亚甲蓝的吸收光谱,曲线2则是添加了抗坏血酸时的光谱图,表明抗坏血酸对亚甲蓝有明显的褪色作用｡

2.2酸度及缓冲溶液､亚甲蓝用量的影响

实验考察了酸度对亚甲蓝褪色反应的影响,结果如图2所示｡从图2可以看出,在pH=0~3的酸度范围内,|A|值比较稳定,所以选定pH=2为测定酸度｡

实验还考察了缓冲溶液用量对褪色反应的影响,pH=2的缓冲溶液的用量对褪色反应的影响并不明显,当其用量在5mL时,吸光度|A|有最大值且比较稳定,因此选定缓冲溶液的最佳用量为5mL｡

亚甲蓝的用量如果不足,较高浓度的抗坏血酸就不能准确测定;如果太大,低浓度的抗坏血酸也难于准确测定,检出限将会提高｡因此,优化亚甲蓝的用量可以在保证准确测定高浓度抗坏血酸的情况下尽可能降低检出限,拓宽工作曲线的线性范围｡实验表明,对于40mg/L抗坏血酸溶液,当亚甲蓝的用量在0.5~3mL时|A|的值较大而且稳定;当亚甲蓝的用量超过3mL时,由于参比溶液的颜色太深而无法读数,同时也降低了检测低浓度抗坏血酸的能力｡因此,选择亚甲蓝的用量为1mL｡

2.3增敏剂的选择及其用量的影响

为了寻找合适的增敏剂,本实验考察了甲醇､乙醇､乙二醇､丙三醇､甲酸､乙酸､苯甲酸､对氨基苯磺酸､水杨酸､柠檬酸､酒石酸､H_酸､苯酚､丙酮､十二烷基苯磺酸钠､十二烷基硫酸钠､十六烷基溴代吡啶､吐温-80､乳化剂-OP､淀粉､环糊精､EDTA等物质对|A|的影响｡实验结果发现只有高浓度的EDTA和对氨基苯磺酸对抗坏血酸和亚甲蓝的反应有增敏作用,而其它物质几乎没有影响;并且发现对氨基苯磺酸的增敏作用远大于EDTA,所以本实验选择对氨基苯磺酸为增敏剂,同时考察了其用量的影响,其溶液用量在1mL到4mL范围内时|A|的值最大而且恒定,因此选择对氨基苯磺酸溶液的用量为2mL｡

2.4反应时间及温度的影响

根据实验方法,在加入抗坏血酸后每5min测量一组数据,连续监测90min｡结果发现抗坏血酸和亚甲蓝能够较快反应,|A|在15~30min内达到最大并保持稳定,但在30min后将缓慢地略有增大,到50min后基本保持恒定｡由于其增加的幅度小于5%,因此仍然选择褪色反应的时间为20min｡实验考察了温度对褪色反应的影响,结果发现在较高温度(50℃以上)下,褪色反应明显加快,但是灵敏度没有明显提高;在较低温度(10~30℃)下,在反应进行20min后进行测量时,温度对褪色反应的影响可以忽略不计｡因此,为了操作的方便,选择在25℃(室温)条件下进行测量｡

2.5标准曲线与检出限

在实验确定的最佳条件下,改变抗坏血酸的加入量,按照实验方法绘制标准曲线｡本法测定抗坏血酸的线性范围是0.4~40mg/L,曲线的回归方程为|A|=3.934C+0.00518(C的单位为mg/L),r=0.9989,标准偏差s=0.0101(n=6),检出限为0.4mg/L(S/N=3σ)｡

2.6干扰实验

实验中分别考察了甲醇､乙醇､乙二醇､丙三醇､甲酸､乙酸､苯甲酸､水杨酸､柠檬酸､酒石酸､H_酸､苯酚､丙酮､十二烷基苯磺酸钠､十二烷基硫酸钠､十六烷基溴代吡啶､吐温-80､乳化剂-OP､淀粉､聚乙烯吡咯烷酮､环糊精､EDTA､脲､葡萄糖､乳糖､硫脲､肼､酒石酸､磷酸根､硫酸根､氟离子､氯离子等物质对褪色反应的影响｡实验结果表明,对测定20mg/L的抗坏血酸,误差≤±5%时,允许如下倍量的物质存在:2500倍的葡萄糖;125倍的EDTA;其他试剂几乎没有影响;高价铁离子等强氧化性金属离子对本法有干扰,但是因为它们不能和抗坏血酸共存,在实际分析中可以不考虑｡因此,本法具有优良的选择性｡

2.7样品分析

2.7.1维生素C药片中抗坏血酸的测定准确称取0.1563g已研碎的吉林市制药厂产的维生素C药片,溶于蒸馏水中,完全转移到100mL棕色容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度｡分取1mL溶液,按实验方法项下进行测量,结果列于表1｡

2.7.2饮料中抗坏血酸的测定取瑞士雀巢食品公司生产的“必是”牌荔枝速溶饮品10g,溶于少量蒸馏水中,完全转移到100mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度｡溶液澄清后,移取1mL,按照实验方法项下进行测定,结果见表1｡

2.7.3蔬菜中维生素C含量的测定 取市售新鲜的西红柿参照文献处理后,移取上清液2mL,按照实验方法项下进行检测,结果如表1所示｡

所有样品的测定结果均采用2,4_二硝基苯肼标准分析方法进行对照,其结果也列入表1中｡从表1可以看出,采用亚甲蓝褪色光度法测定抗坏血酸所得结果与标准法结果一致｡

参考文献:

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典:二部[M].1990年版.北京:人民卫生出版社,1990.643-645.

[2]OLSSONJ , NORDSTROMO , NORDSTROMAC , et al. Dete rmination of ascorbic acid in isolated pea plant cells by capillary electrophoresis and a mperometric detection [J].J Chromatog r,A,1998,826(2):227.

[3]曹志广,丁祥欢,叶建农.维生素片中水溶性维生素的毛细管电泳-电化学法测定[J].分析测试学报,1999,18(5):57.

[4]沈静茹,雷灼霖,丁志刚.测定水果中抗坏血酸的β_环糊精构筑模拟酶催化法[J].分析测试学报,1998,17(6):47.

[5]张德文,黄汉国.固蓝盐B分光光度法测定药物中抗坏血酸[J].分析化学,1993,21(5):597.

[6]刘福岭,戴行钧.食品物理与化学分析方法[M].北京:轻工业出版社,1987.105-108.