SDS-Schiff碱铜(II)配合物模拟酶催化光度法研究

    天然过氧化物酶价格昂贵,且容易失活,对催化反应条件要求苛刻,因此寻求HRP模拟酶显得尤为重要。但模拟酶仅能模拟辅基结构,由于处于游离状态,其催化活性和特异性均不如天然酶。而创造适宜的微环境可有效提高模拟酶的催化活性。本文发现Schiff碱铜配合物Cu(II)-(HNATS)₂模拟酶具有类似辣根过氧化物酶(HRP)的催化活性,而阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)的加入改善了模拟酶所处的微环境,其增溶、增敏的双重作用使模拟酶的催化活性、稳定性和催化显色反应的灵敏度均显著提高。由此建立了新的测定超氧阴离子自由基(O·^-₂)的分光光度法。线性范围为0~9.0×10^-4mol/L,检出限为6.28×10^-6mol/L。30种干扰物质试验证明,大多数生物样品中共存物质无干扰。此法可望成为测定超氧阴离子自由基(O·^-₂)与超氧化物歧化酶(SOD)活性的新方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂 UV-265型紫外-可见分光光度计(日本岛津);pHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂);PE983型红外光谱仪(KBr压片,美国Perkin-Elmer公司);MT-3型CHN元素分析仪(日本柳本公司);高压汞灯(南京工学院电子管厂,附365,405,546和577nm滤光片)。

维生素B₂(VB₂):用0.1mol/LNaOH配成4×10^-4mol/L溶液。4-氨基安替比林(4-AAP)配成2.0×10^-2mol/L水溶液。2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)水溶液:2.0×10^-2mol/L。H₂O₂水溶液:5.0×10^-3mol/L,用30%H₂O₂溶液稀释(KMnO4标定)。2-羟基-1-萘醛缩2-氨基噻唑铜配合物[Cu(II)-(HNATS)₂]为自合成,配成5.0×10^-4mol/LDMF溶液。各类表面活性剂浓度均为1.0×10^-2mol/L。Tris-HCl缓冲溶液0.10mol/L,pH=8.50。实验所用试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水。

1.2 SOD酶提取液的制备 分别将市售大蒜、大葱和洋葱鲜品去皮、去根、洗净晾干,按每克可食部分加2mL50mmol/LpH=7.8的磷酸盐缓冲液,冷冻2h后制成匀浆,定容,将滤液冷冻1h后离心(4000r/min)10min,向上清液中加预冷无水乙醇及氯仿各0.5mL,用混合器振荡混匀1min,离心(4000r/min)5min,将上清液放入透析袋,于pH7.8磷酸盐缓冲液中透析72h,经浓缩得SOD提取液,备用。

1.3 Cu(II)-(HNATS)₂的合成与鉴定 参考文献方法,合成新型Schiff碱铜配合物Cu(II)-(HNATS)₂模拟酶,并通过了红外和元素分析。推测模拟酶可能的结构如图1所示。

1.4 实验方法 在10mL刻度比色管中依次加入2.5mLTris-HCl缓冲溶液(pH=8.50)、3mLSDS溶液、0.3mLCu(II)-(HNATS)2溶液、0.8mL4-AAP溶液、1.8mL2,4-DCP溶液及0.2mLVB2溶液,用水稀释至刻度,摇匀,置于高压汞灯下光照,参比液不光照,在分光光度计上于505nm处测定吸光度A。记录A随光照时间的变化曲线(动力学方法)及达平衡时的A值(静态平 衡法)。样品分析时注入SOD抽提液25μL,光照20min,记录A_505nm,同时做空白实验。

2结果与讨论

2.1 吸收曲线 绘制吸收曲线(如图2,光照时间20min)。比较各体系产物吸收曲线(400~700nm),峰形相同,最大吸收波长均在505nm,说明所得产物为同一醌型化合物。图2曲线a表明在无催化剂存在下反应微弱;曲线b表明模拟酶Cu(II)-(HNATS)₂对反应催化作用较强;曲线c表明SDS可明显提高模拟酶的催化活性,其最大吸收峰位不变;曲线d表明HRP对反应有很好的催化效果。选择505nm为最佳测定波长。

2.2 酸度的影响 在pH=3.0~12.0范围内研究了体系酸度的影响。结果表明,在pH=8.0~9.0范围内,吸光度A稳定且有最大值。本文选0.1mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.50)2.0mL。

2.3 试剂用量的选择 研究结果表明,试剂最佳用量分别为:1.8mL2.0×10^-2mol/L2,4-DCP溶液;0.8mL2.0×10^-2mol/L4-AAP溶液;0.3mL5.0×10^-4mol/LCu(II)-(HNATS)₂溶液;0.2mL4×10^-4mol/LVB₂溶液。

2.4 光照波长及时间的选择 实验结果表明,混合波长(即不附加任何的滤光片)的光照方法为最佳。在0~20min内,吸光度A与光照时间t具有良好的线性关系,此期间吸光度变化值与酶活力成正比。在25~40min内反应速率变慢,曲线弯曲。本文选择光照时间为20min。

2.5 表面活性剂的影响 研究各种类型表面活性剂和β-CD对反应的影响,结果列于表1。由表1可见,阴离子表面活性剂SDS和β-CD对反应有明显的增敏作用,与不加表面活性剂体系相比,分别增敏25.2%和21.1%。而阳离子和非离子表面活性剂均有不同的抑制作用。

SDS浓度在2.5×10^-3~3.5×10^-3mol/L范围内,吸光度A稳定且有最大值,加入量过多,由于妨碍了模拟酶与反应体系间的相互接触,催化效果受到抑制,吸光度明显降低。本文选用1.0×10^-2mol/L的SDS3mL为最佳。

2.6 模拟酶的特性分析 按Lineweaver-Burk双倒数曲线法求出Cu(II )-(HNATS)₂模拟酶(I)与SDS-Cu(II)-(HNATS)₂模拟酶( II)的催化反应动力学常数(表2)。由表2可见,加入SDS使模拟酶的催化活性和专一性显著提高。

2.7 酶催化反应及表面活性剂增敏机理的探讨 该催化偶联显色反应可能的机理如下:

SDS对模拟酶的增敏效果显著,但最大吸收波长未发生改变(见图2),说明并无新的化合物生成,只是改变了模拟酶所处的微环境。SDS与Cu(II)-(HNATS)₂模拟酶间的静电吸引对模拟酶有一定的固定作用,客观上起到稳定模拟酶和提高其活性的作用。

2.8 测定干扰物质的实验 取VB2浓度为8.0×10^-6mol/L,考察了30种无机离子和有机物的干扰,即1000倍以上的Ca²⁺,Cl^-,NO^-₃,Ac^-,SO^2-₄,Br^-,F^-;900倍的Mg²⁺;600倍的Sr²⁺,Ni²⁺;250倍的PO^3-₄,CO^2-₃;200倍的蔗糖,葡萄糖;80倍的Be²⁺;60倍的Al³⁺;50倍的色氨酸,DL-酪氨酸,I-,Zn²⁺;30倍的Cr³⁺;25倍的甘氨酸,L-苯丙氨酸,Pb²⁺;15倍的Hg²⁺;5倍的Fe³⁺;1倍的Co²⁺,Mn²⁺,V⁵⁺,SO^2-3。

2.9 工作曲线 根据2O^·-2+2H⁺=H₂O₂+O₂可知,2molO^·-₂可产生1molH₂O₂,故可用H₂O₂浓度与A₅₀₅的线性关系表达O^·-₂量的关系。实验证明,O^·-₂在0~9.0×10^-4mol/L与A505存在线性关系。工作曲线回归方程为A=0.09787+1002.5×c(O^·-2)/(mol·L^-1)。r=0.9984。10份空白的标准偏差为0.0021,检出限为6.28×10^-6mol/L。

2.10 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定 本法可用于大蒜、大葱、洋葱中SOD活性的测定。并与邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的标准方法进行了比较,结果见表3。