毛细管电色谱(ＣＥＣ)是近年来新发展起来的一种微分离分析技术,它是利用电渗流或电渗流结合压力来推动流动相移动的一种液相色谱分离方法。由于ＣＥＣ主要依靠平板式的电渗流驱动流动相,因此它同时具有毛细管电泳的高分辨率以及高效液相色谱的多选择性。ＣＥＣ出现于１９７４年,直到８０年代才受到人们的重视。ＣＥＣ在发展之初以填充柱为主,但是制作柱端塞子的重复性影响了其进一步的发展;随后发展起来的开管交联键合柱虽然避免了塞子的制作,但是它需要一定的专门制柱技术;而物理吸附涂层柱虽然制柱简单,但是却存在柱寿命短的问题。１９９３年Ｇａｒｎｅｒ等提出了动态ＣＥＣ的概念,首先在空管石英毛细管柱上涂渍ＯＶ-１７Ｖ,然后在缓冲液中加入十六烷基三甲基溴化铵(ＣＴＡＢ),由于非极性相互作用,使ＣＴＡＢ动态吸附于柱的内表面,从而形成了以ＣＴＡＢ为假固定相的动态吸附ＣＥＣ。最近,Ｙｅ等以填充硅胶柱为分离柱,在缓冲液中加入ＣＴＡＢ,利用正负电荷相吸的原理实现了以ＣＴＡＢ为假固定相的动态吸附ＣＥＣ。本文以未经柱壁处理的开管石英毛细管,在缓冲液中加入ＣＴＡＢ或１,５－二甲基－１,５－二氮杂十一烷亚甲基聚Ｎ－甲溴化物（ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅｂｒｏｍｉｄｅ,ＨＤＢ）,以及负电性的磺丁基β－环糊精(ＳＢＥ－β－ＣＤ),实现了双动态吸附ＣＥＣ的手性分离:石英表面的硅羟基解离而带负电,由于静电相吸柱内壁首先与缓冲液中带正电的ＣＴＡＢ或ＨＤＢ吸附形成第一动态吸附层,使柱内壁带正电;然后再与缓冲液中负电性的ＳＢＥ－β—ＣＤ吸附形成第二动态吸附层。以碱性的丙比胺和酸性的华法林作为拆分对象,考察了双动态吸附ＣＥＣ的手性分离能力及动态吸附柱的重复性。
１实验部分
１．１试剂与仪器
ＢｉｏＦｏｃｕｓ３０００型高效毛细管电泳仪(Ｂｉｏ-Ｒａｄ公司,美国);ｐＨＳ-３Ｃ型精密酸度计(上海电光器件厂);石英毛细管柱为０．３５ｍ×５０μｍＩＤ，有效长０．３０ｍ(河北永年光导纤维厂)。ＳＢＥ－β－ＣＤ（实验室自制,平均取代度为３．８）,手性样品均为外消旋体(Ｓｉｇｍａ公司,美国),其它试剂均为分析纯,所用水为二次去离子水。
１．２电泳条件
柱子在每天运行前用０．１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ、Ｈ２Ｏ及运行缓冲液分别洗柱５ｍｉｎ,每两次运行之间用运行缓冲液洗柱５ｍｉｎ。进样采用压力方式:１３．８ｋＰａ·ｓ;分离电压为１５ｋＶ;紫外２１０ｎｍ检测;分离柱温２５℃。
２结果与讨论
２．１ｐＨ值对双动态吸附ＣＥＣ手性分离的影响
配制含２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４、０．４ｍｍｏｌ／ＬＣＴＡＢ及１０ｇ／ＬＳＢＥ－β－ＣＤ的缓冲液,ｐＨ在２．０到９．０之间,考察ｐＨ值对双动态吸附ＣＥＣ的手性分离性能的影响。石英毛细管Ｓｉ—ＯＨ的ｐＩ＜２,当ｐＨ＞２时Ｓｉ—ＯＨ解离后带负电（Ｓｉ—Ｏ-）,缓冲液中的正电性表面活性剂与其静电相互作用,使柱内表面形成第一动态ＣＴＡＢ层,从而使柱子的内表面带正电,之后再静电吸附一层负电性的ＳＢＥ－β－ＣＤ，形成第二动态吸附层,所以在所考虑的ｐＨ值范围内电渗流始终由正极流向负极。在毛细管区带电泳(ＣＺＥ)中随着ｐＨ值的增大,酸性化合物所带的负电荷增多,而碱性化合物所带的正电荷则减少,因此随着ｐＨ值的增大酸性化合物的有效电泳迁移率显著增大,而碱性化合物则显著减小。但是在双动态吸附ＣＥＣ中ｐＨ值对酸、碱性化合物的有效电泳迁移率（μｅｆｆ）的影响不大,这是因为在双动态吸附ＣＥＣ中,由于ｐＨ值的增大使Ｓｉ—ＯＨ解离增大,因此柱壁动态吸附的ＳＢＥ－β－ＣＤ增多,分析物质与柱壁固定相的作用增强,使得正电性的丙比胺与流动相中的ＳＢＥ＿β＿ＣＤ作用的机会减少,从而减小了其被流动相中的ＳＢＥ－β－ＣＤ包结后向正极迁移的机会;而负电性的华发林则由于与柱壁ＳＢＥ－β－ＣＤ作用增强,减小了它向正极迁移的速度。
ｐＨ值对分离度的影响见图１,其中丙比胺在ｐＨ３．０时的分离度(Ｒｓ)最大(为２．５５)，而华发林在ｐＨ为６．０时Ｒｓ最大(为２．３１,当ｐＨ＜６．０时,华发林在３０ｍｉｎ内不出峰)，这说明ｐＨ值对Ｒｓ的影响主要取决于分析物质本身的解离情况。
２．２ＣＴＡＢ浓度对手性分离的影响
选择含２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４、１０ｇ／ＬＳＢＥ－β－ＣＤ及ＣＴＡＢ浓度在０到１．２ｍｍｏｌ／Ｌ之间的缓冲液体系（ｐＨ３．０）。随着ＣＴＡＢ浓度从０．１ｍｍｏｌ／Ｌ增大至１．２ｍｍｏｌ／Ｌ,柱内壁所吸附的ＳＢＥ—β—ＣＤ增多,因此柱壁固定相相对于缓冲液中的ＳＢＥ－β－ＣＤ对丙比胺的作用增强,使丙比胺被流动相中ＳＢＥ－β－ＣＤ包结后向正极迁移的机会减少,从而使其μｅｆｆ逐渐增大(见图２);但是在ＣＴＡＢ由０增至０．１ｍｍｏｌ／Ｌ时丙比胺的μｅｆｆ逐渐减小,这可能是缓冲液的离子强度和粘度随ＣＴＡＢ浓度增大而增大起主导作用所至。
ＣＴＡＢ浓度对丙比胺Ｒｓ的影响见图３,随着ＣＴＡＢ浓度由０增至０．２ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｒｓ逐渐增大,这是动态吸附层中的ＳＢＥ－β－ＣＤ增多的缘故,而随着ＣＴＡＢ由０．２增至１．２ｍｍｏｌ／Ｌ时,Ｒｓ逐渐减少,这可能是由于当ＣＴＡＢ与Ｓｉ—Ｏ-吸附饱和后,再增加ＣＴＡＢ的浓度已不会再增加动态吸附层中的ＳＢＥ－β－ＣＤ的浓度,反而会使其与分析物质竞争性地与ＳＢＥ―β－ＣＤ作用。
２．３ＳＢＥ－β－ＣＤ含量对手性分离的影响
选择含２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４及０．２ｍｍｏｌ／ＬＣＴＡＢ的缓冲液（ｐＨ３．０）,改变ＳＢＥ－β－ＣＤ的含量在０～１０ｇ／Ｌ之间。随着缓冲液中ＳＢＥ－β－ＣＤ含量的增加,柱壁与流动相中的ＳＢＥ－β－ＣＤ的含量都相应增加,因此一方面使丙比胺与流动相和固定相中的手性选择剂之间的作用机会增多,使丙比胺的Ｒｓ逐渐增大,另一方面使丙比胺的μｅｆｆ逐渐减小。
２．４不同阳离子表面活性剂对手性分离的影响
由表１可知在ｐＨ３．０时阳离子表面活性剂ＨＤＢ比ＣＴＡＢ所形成的双动态吸附ＣＥＣ在低ＳＢＥ－β－ＣＤ含量的情况下对丙比胺有较大的分离能力,这是由于ＨＤＢ是聚合物,每一单体含两个正电荷(单位碳原子所含的正电荷比ＣＴＡＢ多),使柱内表面动态吸附ＨＤＢ的量比ＣＴＡＢ多,因此在形成第二动态吸附层时能吸附较多的ＳＢＥ－β－ＣＤ;但是在ｐＨ３．０时,由于柱内表面还存在大部分未解离的Ｓｉ—ＯＨ,因此使得在柱内表面动态吸附表面活性剂的量较少,大部分游离的ＨＤＢ比ＣＴＡＢ更易于与流动相中的手性选择剂相互作用,在高ＳＢＥ－β－ＣＤ含量时,使得在流动相中的手性选择剂所起的作用分额减小,因此以ＣＴＡＢ为阳离子表面活性剂的双动态吸附ＣＥＣ对丙比胺的拆分性能较好。在ｐＨ６．０,以ＨＤＢ所形成的双动态吸附ＣＥＣ在高手性选择剂浓度时丙比胺（华发林在３０ｍｉｎ内未出峰）的Ｒｓ远大于ＣＴＡＢ所形成的双动态吸附ＣＥＣ。这是由于首先柱内表面Ｓｉ—ＯＨ解离完全,吸附阳离子表面活性剂的量较多;其次ＨＤＢ比ＣＴＡＢ所带的正电荷密度大,使得在形成第二动态吸附层时能吸附较多ＳＢＥ－β－ＣＤ的缘故。
２．５双动态吸附ＣＥＣ和ＣＤ-ＣＺＥ的比较
由表１还可看出缓冲液ｐＨ不管是３．０还是６．０,当ＣＴＡＢ浓度为０．２ｍｍｏｌ／Ｌ时,双动态吸附ＣＥＣ对丙比胺的手性分离性能比ＣＤ-ＣＺＥ(ＣＴＡＢ的浓度为０)强,这说明柱壁所吸附的ＳＢＥ—β—ＣＤ在手性分离中确实起到了一定的作用;当ＣＴＡＢ浓度为０．４ｍｍｏｌ／Ｌ时则由于缓冲液中游离的ＣＴＡＢ和分析物质竞争性地与ＳＢＥ—β—ＣＤ相互作用,使得丙比胺的Ｒｓ反而比在ＣＤ-ＣＺＥ情况下小。
以ＨＤＢ作为阳离子表面活性剂时,在ｐＨ３．０的缓冲液中ＳＢＥ—β—ＣＤ低含量的情况下,由于在柱壁动态吸附的ＳＢＥ—β—ＣＤ的作用,丙比胺的Ｒｓ在双动态吸附ＣＥＣ时远大于ＣＤ-ＣＺＥ,而在ＳＢＥ—β—ＣＤ高含量的情况下,则Ｒｓ反而小于ＣＤ-ＣＺＥ,这是由于流动相中部分ＳＢＥ—β—ＣＤ与ＨＤＢ相互作用的缘故;当缓冲液在ｐＨ６．０时,由于柱壁Ｓｉ—ＯＨ解离增多,使得吸附ＨＤＢ的量增多,进而使得柱壁动态吸附ＳＢＥ—β—ＣＤ的量也增多,因此即使是在ＳＢＥ－β－ＣＤ高含量下丙比胺的Ｒｓ在双动态吸附ＣＥＣ的情况下远大于ＣＤ-ＣＺＥ。
２．６双动态吸附ＣＥＣ的重复性
考察如下４种背景电解质体系下的双动态吸附柱的重复性:(１)ｐＨ３．０、２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４、０．２ｍｍｏｌ／ＬＣＴＡＢ及２ｇ／ＬＳＢＥ—β—ＣＤ;(２)ｐＨ６．０、２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４、０．２ｍｍｏｌ／ＬＣＴＡＢ及２ｇ／ＬＳＢＥ－β－ＣＤ；(３)ｐＨ３．０、２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４、０．３ｇ／ＬＨＤＢ和２ｇ／ＬＳＢＥ－β－ＣＤ；(４)ｐＨ６．０、２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４、０．３ｇ／ＬＨＤＢ及２ｇ／ＬＳＢＥ－β－ＣＤ。分别以上述４种缓冲液体系连续运行１０次,每次之间用该缓冲液体系浸泡柱子５ｍｉｎ,所得到的丙比胺出峰时间的相对标准偏差(ＲＳＤ)见表２。由表２可知在各缓冲液体系下,丙比胺出峰时间的ＲＳＤ都小于１．０%,这说明双动态吸附ＣＥＣ不但具有很好的重复性,而且不同双动态涂层之间转换既简单又快速。
３结论
双动态吸附ＣＥＣ可以在低手性选择剂含量的情况下获得比ＣＤ-ＣＺＥ理想的手性拆分效果,在高ｐＨ值下或低手性选择剂含量时,以ＨＤＢ为阳离子表面活性剂比ＣＴＡＢ能获得更好的拆分效果,因此选择适当的双动态ＣＥＣ可为手性分离节约较为昂贵的手性选择剂。作为毛细管电泳的又一分离模式,双动态吸附ＣＥＣ有值得进一步研究的应用和理论价值。
